Мембрана наружная: Что такое наружная мембрана. Какие функции выполняет наружная клеточная мембрана? Строение наружной клеточной мембраны

Мембрана наружная: Что такое наружная мембрана. Какие функции выполняет наружная клеточная мембрана? Строение наружной клеточной мембраны

Содержание

Наружная клеточная мембрана — Биология


Мембраны биологические. 

Термин «мембрана»(лат. membrana — кожица, пленка) начали использовать более 100 лет назад для обозначения  клеточной границы, служащей, с одной стороны, барьером между содержимым клетки и внешней средой, а с другой — полупроницаемой перегородкой, через которую могут  проходить вода и некоторые вещества. Однако этим функции мембраны не исчерпываются, поскольку биологические мембраны составляют основу структурной  организации клетки .
Строение мембраны. Со гласно этой модели  основной мембраны является липидный бислой , в котором гидрофобные хвосты  молекул обращены  внутрь, а гидрофильные головки-наружу. Липиды представлены фосфолипидпми — производными глицерина или сфингозина. С липидным слоем связаны белки. Интегральные(транмембраные) белки пронизывают мембрану насквозь и прочно с ней связаны;  переферические не  пронизывают и связаны с мембраной менее прочно. Функции мембраных белков: поддержание структуры мембран, получение и преобразование сигналов из окр. среды, транспорт некоторых веществ, катализ реакций, происходящих на мембранах. толщина мембраны составляет от 6 до 10 нм.

Свойства мембраны:
1. Текучесть. Мембрана не представляет собой жесткую структуру- большая  часть входящих в ее состав белков и липидов может перемещаться  в плоскости мембран.
2. Асимметрия. Состав наружного и  внутреннего слоев как белков, так и липидов различен. Кроме того, плазматические мембраны животных клеток снаружи имеют слой гликопротеинов (гликокаликс, выполняющий  сигнальную и рецепторные функции,  а также имеющий  значение для объединения клеток в ткани)
3. Полярность . Внешняя сторона мембраны несет положительный заряд, а внутренняя-отрицательный.
4. Избирательная проницаемость. Мембраны живых клеток пропускают, помимо воды, лишь определенные молекулы и ионы растворенных веществ.(Использование по отношению к мембранам клеток термина «полупроницаемость» не совсем корректно, тк это понятие подразумевает то, что мембрана пропускает только молекулы растворителя, задерживая при этом все молекулы и ионы растворенных веществ. )

Наружная клеточная мембрана (плазмалемма) —  ультрамикроскопическая  пленка толщиной  7.5нм , состоящая из белков, фосфолипидов и воды. Эластичная пленка, хорошо смачвающася водой и быстро восстанавливающийся целостность после повреждения. Имеет универсальное строение, те типичное для всех биологических мембран. Пограничное положение этой мембраны, ее участие в процессах избирательной проницаемости, пиноцитозе, фагоцитозе, выведение продуктов выделения и синтез, во взаимосвязи  с соседними клетками и защите клетки от повреждений делает ее роль исключительно важной. Животные клетки снаружи  от мембраны  иногда бывают покрыты тонким слоем,состоящим из полисахаридов и белков, — гликокаликсом. У растительных клеток  снаружи от клеточной мембраны находится прочная, создающая внешнюю опору  и поддерживающая форму клетки клеточная стенка. Она состоит из клетчатки (целлюлозы)-нерастворимого в воде полисахарида.

Мембраны наружные — Справочник химика 21





    Внутренняя мембрана Наружная мембрану Строма [c. 47]

    Две стороны мембраны, наружная и внутренняя, различаются и по составу, и по функциям. [c.185]

    Каким же образом химическое разложение родопсина на свету приводит к генерированию потенциала действия Это связано с изменением мембран наружного и внутреннего сегментов палочек (рис. 17.38). Во внутреннем сегменте палочки функционирует натриевый насос, непрерывно выкачивающий из клетки ионы натрия. В темноте мембрана наружного сегмента для них проницаема, и они диффундируют назад, в результате чего поддерживается стабильный мембранный потенциал (—40 мВ, а не —70 мВ, как у [c.326]








    Из трех основных действующих лиц мембранной теории — мембрана, наружная среда, внутренняя среда — довольно хорошо была исследована лишь наружная среда, и не только потому, что она была наиболее доступной. Химическим составом среды, окружающей клетки организма, биологам уже давно пришлось заниматься вне всякой связи с мембранной теорией. При любых экспериментах на изолированных органах их нужно держать в специально подобранном растворе. Например,, сердце лягушки нельзя оставлять просто на воздухе — оно высохнет и перестанет работать, но нельзя поместить его и в воду — под действием осмоса клетки органа погибнут. [c.66]

    Внутренняя мембрана. Наружная мембрана. [c.38]

    Все митохондрии состоят из двух отдельных мембранных мешков. Мембрана внутреннего мешка отдалена на 50—100 А от мембраны наружного, которая образует границу между клеточным соком и содержимым митохондрии. Наружная мембрана примерно на 50% состоит из липида и на 50% —из белка. Внутренняя мембрана— это более плотная структура, около 3/4 массы которой составляет белок, а 1/4 — смешанные липиды. Внутренняя мембрана, как правило, располагается параллельно наружной, по всей окружности частицы, но характеризуется присутствием больших направленных внутрь складок (инвагинаций), называемых кристами (рис. 12.7). В митохондриях печени кристы составляют единое целое с внутренней мембраной эта непрерывность менее очевидна в митохондриях из других источников. Внутренние поверхности крист, обращенные к матриксу, усеяны маленькими выступающими структурами, называемыми элементарными тельцами или частицами внутренних митохондриальных мембран. Эти частицы состоят [c.418]

    Белковый состав разных мембран различен. Например, плазматическая мембрана клеток печени содержит сотни разных белков, а мембраны наружных сегментов палочек сетчатки глаза — лишь несколько белков, в основном родопсин (зрительный пурпур). [c.204]

    Плазматич. мембрана наружного сегмента в темноте высоко проницаема для ионов Na» , благодаря чему эти ионы быстро проникают внутрь наружного сегмента (высокий градиент в мембране концентрации ионов Na поддерживает Na , К -аденозинтрифосфатаза), диффундируют далее во внутр. сегмент и затем выводятся с помощью Na» , -насоса за счет энергии АТФ. [c.273]

    Функция наружной мембраны. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий выполняет не только механические, но и важные физиологические функции. В ее двойной липидный слой, состоящий из липида А, полисахаридов и фосфолипидов, встроены белки, пронизывающие этот слой насквозь. Вероятно, эти трансмембранные белки представляют собой заполненные водой каналы — гидрофильные поры в лйпофильной мембране поэтому их называют норинами. Существует несколько различных поринов. Они пропускают через мембрану гидрофильные низкомолекулярные вещества (вплоть до молекулярной массы порядка 6000). [c.17]

    Функция наружной мембраны. Наружная мембрана грам-отрицательных бактерий выполняет не только механические, но и важные физиологические функции. В ее двойной липидный слой, состояищй из липида А, полисахаридов и фосфолипидов, встроены белки, пронизываю-пще этот слой насквозь. Вероятно, эти трансмембранные белки представляют собой заполненные водой каналы-гидрофильные поры в липофильной мембране поэтому их называют поринами. Существует [c.59]








    Что же делает этот внутриклеточный медиатор Оказывается, мембрана внутреннего сегмента палочки достаточно обычна — стандартна по своим свойствам она содержит К-каналы, создающие ПП. А вот мембрана наружного сегмента необычна она содержит только Ка-кана-лы. В покое они открыты, и хотя их не очень много (так что удельное сопротивление этой мембраны весьма высоко, порядка 1 МОм-см ), этого достаточно, чтобы идущий через них ток снижал МП, деполяризуя палочку (см. рис. 59, а). Так вот, внутриклеточный медиатор способен закрывать часть Ка-каналов, при этом сопротивление нагрузки растет и МП тоже нарастает, приближаясь к калиевому равновесному потенциалу (рис. 59, б). В результате палочка при действии на нее света гиперполяризуется. [c.234]

    Оказалось, что, например, у митохондрий, как и у бактерий, имеются две мембраны. Наружная имеет довольно крупные поры. Но у бактерий эта наружная стенка прочная, так как она должна защищать клетку от возможности осмотического разрушения, а у митохондрии она потеряла механическую прочность, так как клетка-хозяин заботится о поддержании постоянных осмоти- [c.275]








    При улавливании света палочкой происходит изменение внутриклеточной концентрации как Са , так и GMP, поэтому любая из этих молекул могла бы в принципе служить внутриклеточным посредником. С помощью метода исследования небольщих участков мембраны (разд. 4.2.3) установлено, что ключевым сигналом служит падение конпентрапии пиклического GMP в нитозоле. В решающем эксперименте небольшой участок мембраны наружного сегмента отсасывали с помощью микроэлектрода, и тогда внутренняя сторона этого участка становилась доступной для воздействий (рис. 19-53). Когда в среду, омывающую [c.343]

    Доказательством несовместимости плазмалеммы с мембранами эндоплазматической сети служит структура плазмодесмы, соединяющей прилегающие клетки через разделяющую их первичную оболочку (рис. 14), на поперечном сечении которой видны две концентрические мембраны наружная, представляющая собой плазмалемму, и внутренняя — мембрана эндоплазматической сети, обеспечивающая непрерывность этой системы мембран по обе стороны клеточной оболочки. В период дифференци-ровки между прилегающими клетками по каналам плазмодесм происходит обмен энхилемой — разбавленным раствором водо- [c. 35]

    В 1938 г. Зелиг Хехт (Selig He ht) открыл, что для возбуждения палочки (клетки) сетчатки человека достаточно одного фотона. Рассмотрим молекулярную основу исключительно высокой чувствительности этих клеток. Палочки представляют собой тонкие удлиненные структуры диаметром обычно 1 мкм и длиной 40 мкм. Основные функции этой клетки четко разделены пространственно (рис. 37.22). Наружный сегмент палочки специализирован для фоторецепции. В нем содержится примерно 1000 дисков, сложенных стопкой (рис. 37.23). Диски представляют собой закрытые уплощенные мешочки толщиной около 160 А. Эти мембранные структуры насыщены фоторецепторными молекулами. Мембраны дисков и плазматическая мембрана наружного сегмента не соприкасаются. Тонкая ресничка соединяет наружный сегмент с внутренним сегментом, богатым митохондриями и рибосомами. Во внутреннем сегменте с очень высокой скоростью вырабатывается АТР и идет активный синтез белков. Диски наружного сегмента имеют срок жизни всего лишь 10 дней и постоянно обновляются. Внутренний сегмент соприкасается с ядром, расположенным рядом с синаптическим тельцем. Синаптическое тельце, в котором содержится много синаптических пузырьков, образует синапс с биполярными клетками. [c.340]

    Свет вызывает гнпернолярнзацню плазматической мембраны наружного сегмента налочек [c.344]

    Изомеризация ретиналя из цис- в трансформу и последующие конформационные изменения родопсина-это первичные акты процесса зрительного возбуждения. Следующий важный этап, необходимый для генерирования нервного импульса, был выявлен при электрофизиологических исследованиях интактной сетчатки. Квант света вызывает кратковременную гиперполяризацию плазматической мембраны наружных сегтиентов (рис. 3729). Кинетика процесса гиперполяризации зависит от интенсивности светового пучка и уровня устойчивого фонового освещения. Время реакции на единичный фотон составляет около секунды, а на интенсивный падающий свет — несколько миллисекунд. В палочках не возникает потенциала действия. Их реакция на свет может быть различной силы. Величина сигнала, идущего от наружного сегмента к синапсу, зависит от числа поглощенных фотонов. Если взять обладающие полной чувствительностью адаптированные к темноте палочки, то полумаксимальный уровень гиперполяризации наблюдается при поглощении всего лищь 30 фотонов наружным сегментом палочки, содержащим 40 10 молекул родопсина (рис. 37.30). Поглощение единичного фотона адаптированной к темноте палочкой вызывает гиперполяризацию порядка 1 мВ, что улавливается синапсом и передается на другие нейроны сетчатки. Исключительная чувствитель- [c.344]


Наружная клеточная мембрана — Справочник химика 21








    У всех фотосинтезирующих организмов, включая высшие растения, фотосинтез протекает в мембранных структурах. У пурпурных бактерий поглощающие свет пигменты (бактериальные хлорофиллы и каротины) встроены в мембраны, которые представляют собой складки наружной клеточной мембраны. Эти участки имеют характерную структуру и называются хроматофорами. Они состоят из соединяющихся между собой полых пузырьков, параллельно расположенных трубочек или параллельных пластинок (ламелл) диаметр всей структуры — 50—100 нм. У зеленых бактерий пигменты выстилают внутриклеточные пузырьки. В настоящее время фотосинтезирующие бактерии обитают только в серных источниках и глубоких озерах, но когда-то они были, вероятно, распространены гораздо более широко и являлись единственными фотосинтезирующими организмами на Земле. [c.25]

    Тонкая ( 8 нм) наружная клеточная мембрана — плазмалемма (рис. 1-4)—регулирует поток веществ в клетку и из клетки, проводит импульсы в нервных и мышечных волокнах, а также участвует в химических взаимодействиях с другими клетками. Складки наружной мембраны нередко вдаются глубоко внутрь клетки, в цитоплазму так, на—Пример, в клетках поперечнополосатых мышц они образуют трубочки Т-системы, которая участвует в проведении возбуждения, инициирующего процесс сокращения (гл. 4). Складки плазматической мембраны могут соединяться с ядерной оболочкой, создавая прямые каналы (один или несколько) между внеклеточной средой и перинуклеарным пространством [12]. [c.29]

    Эта система участвует не только в синтезе ферментов, которые сек-ретируются клеткой, но и в образовании новых мембран. По-видимому, шероховатый ЭР поставляет мембранный материал гладкому ЭР и аппарату Гольджи, а компоненты мембран Гольджи включаются в состав наружной клеточной мембраны. В растительных клетках наружные мембраны митохондрий и мембраны, окружающие вакуоли, также образуются непосредственно из ЭР [19]. Компоненты наружных клеточных мембран, вероятно, могут использоваться повторно, включаясь в соответствующую структуру в ходе эндоцитоза [20]. [c.33]

    Механизмы, обеспечивающие регуляцию произвольного сокращения мышц, не менее удивительны, чем сам процесс сокращения. Эндоплазматический (саркоплазматический) ретикулум в клетках мышц характеризуется высокой степенью упорядоченности [91, 92]. Соединительные трубочки проходят вдоль нитей, располагаясь среди пучков сократительных элементов, и через строго определенные интервалы тесно контактируют со складками наружной клеточной мембраны (Т-система мембран, рис. 4-22, А). Нервный импульс попадает в мышечное волокно, прохо- [c.324]

    Считают, что антигены А и В, ответственные за агглютинацию зрелых эритроцитов под действием специфических антител, связаны главным образом с гликопротеидами [81, 82], однако известны также антигены, связанные с гликосфинголипидами (табл. 2-8) наружной клеточной мембраны [83—85]. При болезни Фабри (гл. 12, разд. Г.1) [84] в числе прочих продуктов в избытке накапливается гликолипид, проявляющий свойства антигена В. [c.377]

    Помимо слоев клеточной стенки, типичных для большинства грамотрицательных эубактерий, у некоторых представителей этой группы обнаружены дополнительные слои разной электронной плотности, располагающиеся с внешней стороны от наружной клеточной мембраны. Однако до настоящего времени не ясно, относятся ли они к клеточной стенке, являясь результатом ее последующего усложнения, или же представляют собой структурные элементы многослойного чехла. [c.35]

    Компоненты клеточной стенки внутренний слой (пептидогликано-вый) внешний слой (наружная клеточная мембрана) [c.25]

    Радиационно-индуцированные изменения свойств клеточных мембран продемонстрированы также на эпителиальных клетках кишечника человеке. После облучения в дозе 30 Гр микроворсинки на поверхности этих клеток набухают, и вся клетка раздувается, что, вероятно, является результатом потери клеточной мембраной способности регулировать обмен электролитов. Подобные изменения проницаемости наружной клеточной мембраны после облучения обнаружены также в эритроцитах, мышечных клетках и дрожжах. [c.44]

    Установлено также, что ксидифон защищает наружную клеточную мембрану эритроцитов и Т-лимфоциты от иммунного повреждения, связывая Са +. Этот факт может иметь важное значение для понимания механизмов развития и лечения ряда заболеваний, прн которых ведущим патогенетическим эвеном является нарушение на иммунной основе целостности наружной клеточной мембраны. [c.499]

    Амеба — одноклеточный организм, принадлежащий к подцарству простейших (Protozoa). Форма ее тела непостоянна и при движении меняется. Диаметр ее обычно меньше 1 мм, так что отношение поверхности тела к объему достаточно велико, что вообще характерно для одноклеточных организмов. Дыхательной поверхностью амебе служит наружная клеточная мембрана. Диффузия газов осуществляется через всю поверхность тела с достаточно большой скоростью, чтобы удовлетворить все метаболические нужды этого животного. Кислород поступает в клетку, а СО2 выходит из клетки по своим собственным диф- [c.359]

    Инсулин представляет собой небольшой полипептид, состоящий из 51 аминокислотного остатка. Первичная структура инсулина (рис. 3.28) была установлена в 1950 г. Фредом Сэнгером в Кембридже. Этот гормон вьщеляется в ответ на повышение концентрации глюкозы в крови выше 90 мг% (т. е. 90 мг/100 мл). Инсулин переносится плазмой крови в связанной с Р-глобули-ном форме и действует на все органы, хотя наиболее сильное действие он оказывает на печень и мышцы. Связывание инсулина с рецепторами наружной клеточной мембраны ведет к изменению ее проницаемости и активации ряда ферментных систем. Это вызывает в клетке следующие эффекты  [c.348]

    В растительных клетках нити веретена во время телофазы начинают исчезать они сохраняются лишь в области экваториальной пластинки. Здесь они сдвигаются к периферии клетки, число их увеличивается и они образуют боченковидное тельце — фрагмопласт. В эту область перемещаются также микротрубочки, рибосомы, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи последний образует множество мелких пузырьков, наполненных жидкостью. Пузырьки появляются сначала в центре клетки, а затем, направляемые микротрубочками, перемещаются и сливаются друг с другом, образуя клеточную пластинку, расположенную в экваториальной плоскости (см. рис. 5.30). Содержимое пузырьков участвует в построении новой срединной пластинки и стенок дочерних клеток, а из их мембран образуются новые наружные клеточные мембраны. Клеточная пластинка, разрастаясь, в конце концов сливается со стенкой родительской клетки и полностью разделяет две дочерние клетки. Новообразованные клеточные стенки называют первичными в дальнейшем они могут дополнительно утолщаться за счет отложения целлюлозы и других веществ, таких как лигнин и суберин, образуя вторичную клеточную стенку. В определенных участках клетки пузырьки клеточной пластинки не сливаются, так что между соседними дочерними клетками сохраняется контакт. Эти цитоплазматические каналы выстланы клеточной мембраной и образуют структуры, называемые плазмодесмами. [c.150]

    В отличие от грамположительных бактерий фактически все грамотрицательные бактерии имеют в своем составе муреин, который чувствителен к лизоциму. Однако наружная мембрана грамотрицательных бактерий непроницаема для лизоцима, и для того чтобы лизоцим подействовал, ее целостность должна быть нарушена. Этого добиваются замораживанием — оттаиванием, предварительной обработкой ЭДТА или в некоторых случаях обработкой антибиотиками, действующими на мембраны, такими, как полимиксин В. Гидролиз муреи-на в грамотрицательных бактериях не приводит к удалению наружной клеточной мембраны, поэтому образующиеся чувствительные к изменению осмотического давления структуры называют не протопластами, а сферо-пластами. [c.146]

    Для выделения содержимого периплазмы клетки Е. oli обрабатывают лизоцимом, затем подвергают легкому осмотическому шоку [15] (табл. 4.2). В описанном методе используется высокая концентрация трис-НС1 для дестабилизации наружной клеточной мембраны, позволяющей лизоциму проникнуть через слой пептидогликанов. ЭДТА способствует этому процессу, а Mg-+ — препятствует. [c.100]

    Внешний сигнальный агент, называемый первичным мессенджером, как правило, не проникает внутрь клетки, а специфически взаимодействует с рецепторами наружной клеточной мембраны. В качестве первичных мессенджеров выступают различные химические соединения (гормоны, нейромедиаторы) или физические факторы (квант света). Однако гидрофобные стероидные и тиреоидные гормоны способны диффундировать через липидный бислой внутрь клетки и связываться с растворимыми рецепторными белками. Если внешняя сигнальная молекула воздействует на рецепторы клеточной мембраны и активирует их, то последние передают полученную информацию на систему белковых компонентов мембраны, называемую каскадом передачи сигнала. Мембранные белки каскада передачи сигнала подразделяют на белки-преобразователи, связанные с рецепторами, и ферменты-усилители, связанные с белками-преобразователями и активирующие вторичные внутриклеточные мессенджеры, перено- [c.64]

    Активируя выражение одних оперонов, комплекс цАМФ — БАК подавляет экспрессию других. Это показано, в частности, для гена суа, который, следовательно, подвержен негативной ауторегуляции, а также для гена отрА, кодирующего белок наружной клеточной мембраны.[c.35]

    Клетку можно представить как систему взаимосвязанных мембран, так как имеются небезосновательные предположения, что наружная мембрана клетки, эндоплазматический ретикулум, митохондриальная, лизосомная, ядернея мембраны и аппарат Гольджи тесно связаны между собой. Одна из функций наружной клеточной мембраны — регуляция обмена веществ между внутриклеточным пространством и внешней средой. Тем не менее еще мало известно о динамике и функции клеточных мембран или о деталях той регулирующей роли, которую они могут играть. Описано несколько случаев, когда облучение влияло на внешние клеточные мембраны. Например, облучение в дозах в диапазоне несколько десятков грей вызывает уменьшение проводимости нервного импульса в изолированных периферических нервах взрослых животных. Как известно, передача нервного импульса — результат избирательной диффузии ионов натрия и калия через мембрану аксона. Такие изменения электрической активности нервов, вызванные облучением, указывают на увеличение у аксона пассивной проницаемости для ионов. Изменения поведения и функции центральной нервной системы взрослых животных обнаруживаются после облучения в такой низкой дозе, как 0,5 Гр. Неизвестно, являются ли эти эффекты результатом первичных радиационных повреждений нервной ткани или же они обусловлены косвенным эффектом токсинов, освобождающихся из других поврежденных облучением тканей органов и систем. [c.44]


1_1 Строение клеточной мембраны | Кинезиолог

Клеточная мембрана (плазм

алемма или плазмолемма)

Определение понятия

Клеточная мембрана (синонимы: плазмалемма, плазмолемма, цитоплазматическая мембрана, биомембрана) — это тройная липопротеиновая (т.е. «жиро-белковая») оболочка, отделяющая клетку от окружающей среды и осуществлящая управляемый обмен и связь между клеткой и окружающей её средой.

Главное в этом определении — не то, что мембрана отделяет клетку от среды, а как раз то, что она соединяет клетку с окружающей средой. Мембрана — это активная структура клетки, она постоянно работает.

Биологическая мембрана — это ультратонкая бимолекулярная пленка фосфолипидов, инкрустированная белками и полисахаридами. Эта клеточная структура лежит в основе барьерных, механических и матричных свойств живого организма (Антонов В.Ф., 1996).

Образное представление о мембране

Мне клеточная мембрана представляетсся в виде решетчатого забора с множеством дверей в нём, который окружает некую территорию. Всякая мелкая живность может через этот забор свободно перемещаться туда и обратно. Но более крупные посетители могут входить только через двери, да и то не всякие. У разных посетителей ключи только от своих дверей, и через чужие двери они проходить не могут. Так вот через этот забор постоянно идут потоки посетителей туда и обратно, потому что главная функция мембраны-забора двойная: отделять территорию от окружающего пространства и в то же время соединять её с окружающим пространством. Для этого и существует в заборе множество отверстий и дверей — транспортных механизмов мембраны!

Свойства мембраны

1. Проницаемость.

2. Полупроницаемость (частичная проницаемость).

3. Избирательная (синоним: селективная) проницаемость.

4. Активная проницаемость (синоним: активный транспорт).

5. Управляемая проницаемость.

Как видим, основное свойство мембраны — это её проницаемость по отношению к различным веществам.

6. Фагоцитоц и пиноцитоз.

7. Экзоцитоз.

8. Наличие электрических и химических потенциалов, точнее разности потенциалов между внутренней и наружной сторонами мембраны. Образно можно сказать, что «мембрана превращает клетку в «электрическую батарейку» с помощью управления ионными потоками». Подробности: смотреть тут.

9. Изменения электрического и химического потенциала.

10. Раздражимость. Специальные молекулярные рецепторы, находящиеся на мембране, могут соединяться с сигнальными (управляющими) веществами, вследствие чего может меняться состояние мембраны и всей клетки. Молекулярные рецепторы запускают биохимические реакции в ответ на соединение с ними лигандов (управляющих веществ). Важно отметить, что сигнальное вещество воздействует на рецептор снаружи, а изменения продолжаются внутри клетки. Получается, что мембрана передала информацию из окружающей среды во внутреннюю среду клетки.

11. Каталитическая ферментативная активность. Ферменты могут быть встроены в мембрану или связаны с её поверхностью (как внутри, так и снаружи клетки), и там они осуществляют свою ферментативную деятельность.

12. Изменение формы поверхности и её площади. Это позволяет мембране образовывать выросты наружу или, наоборот, впячивания внутрь клетки.

13. Способность образовывать контакты с другими клеточными мембранами.

14. Адгезия — способность прилипать к твёрдым поверхностям.

 

Краткий список свойств мембраны
  • Проницаемость.
  • Эндоцитоз, экзоцитоз, трансцитоз.
  • Потенциалы.
  • Раздражимость.
  • Ферментная активность.
  • Контакты.
  • Адгезия.

 Функции мембраны

1. Неполная изоляция внутреннего содержимого от внешней среды.

2. Главное в работе клеточной мембраны — это обмен различными веществами между клеткой и межклеточной средой. Этому служит такое свойство мембраны как проницаемость. Кроме того, мембрана регулирует этот обмен за счёт того, что регулирует свою проницаемость.

3. Ещё одна важная функция мембраны — создание разности химических и электрических потенциалов между её внутренней и наружной сторонами. За счёт этого внутри клетка имеет отрицательный электрический потенциал — потенциал покоя.

4. Через мембрану осуществляется также информационный обмен между клеткой и окружающей её средой. Специальные молекулярные рецепторы, расположенные на мембране, могут связываться с управляющими веществами (гормонами, медиаторами, модуляторами) и запускать в клетке биохимические реакции, приводящие к различным изменениям в работе клетки или в её структурах.

Видео: Строение мембраны клетки

Видеолекция: Подробно о строении мембраны и транспорте

 Строение мембраны

Клеточная мембрана имеет универсальное трёхслойное строение. Её срединный жировой слой является сплошным, а верхний и нижний белковые слои покрывают его в виде мозаики из отдельных белковых участков. Жировой слой является основой, обеспечивающей обособление клетки от окружающей среды, изолирующей её от окружающей среды. Сам по себе он очень плохо пропускает водорастворимые вещества, но легко пропускает жирорастворимые. Поэтому проницаемость мембраны для водорастворимых веществ (например, ионов), приходится обеспечивать специальными белковыми структурами — транспортёрами и ионными каналами. Зато важнейшие для всего живого газы — кислород и углекислый газ — легко перемещаются через мембрану как внутрь клетки, так и наружу.

Ниже представлены микрофотографии реальных клеточных мембран контактирующих клеток, полученные с помощью электронного микроскопа, а также схематический рисунок, показывающий трёхслойность мембраны и мозаичность её белковых слоёв. Для увеличения изображения кликните на него.

 

 

 

 

 

 

 

 

 Отдельное изображение внутреннего липидного (жирового) слоя клеточной мембраны, пронизанного интегральными встроенными белками. Верхний и нижний белковые слои удалены, чтобы не мешать рассмотрению липидного двойного слоя

Рисунок выше: Неполное схематичное изображение клеточной мембраны (клеточной оболочки), приведённое в Википедии.

Учтите, что наружный и внутренний слои поверхностных белков здесь с мембраны сняты, чтобы нам лучше был виден центральный жировой двойной липидный слой. В реальной клеточной мембране сверху и снизу по жировой плёночке (мелкие шарики на рисунке) плавают большие белковые «острова», и мембрана получается более толстой, трёхслойной: белок-жир-белок. Так что она на самом деле похожа на сэндвич из двух белковых «кусков хлеба» с жирным слоем «масла» посередине, т.е. имеет трёхслойное строение, а не двухслойное.

На этом рисунке маленькие голубые и белые шарики соответствуют гидрофильным (смачиваемым) «головкам» липидов, а присоединённые к ним «ниточки» — гидрофобным (несмачиваемым) «хвостам». Из белков показаны только интегральные сквозные мембранные белки (красные глобулы и желтые спирали). Желтые овальные точки внутри мембраны — это молекулы холестерола Желто-зеленые цепочки бусинок на наружной стороне мембраны — цепочки олигосахаридов, формирующие гликокаликс. Гликокаликс — это как бы углеводный («сахарный») «пушок» на мембране, образованный торчащими из неё длинными белково-углеводными молекулами.

Модель цитоплазматической мембраны: Перейти для просмотра

Живая клетка — это маленький «белково-жировой мешочек», заполненный полужидким желеобразным содержимым, которое пронизано плёнками и трубочками.

Стенки этого мешочка образованы двойной жировой (липидной) плёночкой, облепленной изнутри и снаружи белками — клеточной мембраной. Поэтому говорят, что мембрана имеет трёхслойное строение: белки-жиры-белки. Внутри клетки также есть множество подобных жировых мембран, которые делят её внутреннее пространство на отсеки (=компартменты). Такими же мембранами окружены клеточные органеллы: ядро, митохондрии, хлоропласты. Так что мембрана — это универсальная молекулярная структура, свойственная всем клеткам и всем живым организмам.

Слева — уже не реальная, а искусственная модель кусочка биологической мембраны: это мгновенный снимок жирового фосфолипидного бислоя (т.е. двойного слоя) в процессе его молекулярно-динамического моделирования. Показана расчётная ячейка модели — 96 молекул ФХ (фосфатидилхолина) и 2304 молекулы воды, всего 20544 атомов.

Справа — наглядная модель одиночной молекулы того самого липида, из которых как раз и собирается мембранный липидный бислой. Вверху у него гидрофильная (водолюбивая) головка, а снизу — два гидрофобных (боящихся воды) хвостика. У этого липида есть простое название: 1-стероил-2-докозагексаеноил-Sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (18:0/22:6(n-3)cis ФХ), но вам нет нужды его запоминать, если вы только не планируете довести своего преподавателя до обморока глубиной своих познаний.

Можно дать и более точное научное определение клетке:

Клетка – это ограниченная активной мембраной, упорядоченная, структурированная неоднородная система биополимеров, участвующих в единой совокупности обменных, энергетических и информационных процессов, и также осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.

Внутри клетка также пронизана мембранами, а между мембранами находится не вода, а вязкий гель/золь изменяемой плотности. Поэтому взаимодействующие молекулы в клетке не плавают свободно, как в пробирке с водным раствором, а в основном сидят (иммобилизованы) на полимерных структурах цитоскелета или внутриклеточных мембранах. И химические реакции поэтому проходят внутри клетки почти как в твердом теле, а не в жидкости. Наружная мембрана, окружающая клетку, также облеплена ферментами и молекулярными рецепторами, что делает её очень активной частью клетки.

Клеточная мембрана (плазмалемма, плазмолемма) — это активная оболочка, отделяющая клетку от окружающей среды и связывающая её с окружающей средой. © Сазонов В.Ф., 2016.

Из этого определения мембраны следует, что она не просто ограничивает клетку, а активно работает, связывая её с окружающей её средой.

Мембранные липиды

Жир, из которого состоят мембраны, — особенный, поэтому его молекулы принято называть не просто жиром, а «липидами», «фосфолипидами», «сфинголипидами».

В состав липидов мембран входят в основном фосфолипиды, сфингомиелины и холестерин, а также в меньших количествах гликолипиды.

С химической точки зрения фосфолипид состоит из четырёх частей: глицерина, двух жирных кислот с длинной углеводородной цепью, фосфорной кислоты и особой для каждого фосфолипида группы, которую принято называть характеристической группой. Трёхатомный спирт глицерин связывает через сложно-эфирную связь две жирные кислоты и остаток фосфорной кислоты, к которой присоединена характеристическая группа (например, этаноламин).

Рис. ___. Структурная формула фосфатидилэтаноламина как пример амфифильной (гидрофобной/гидрофильной) молекулы фосфолипида. Кроме этаноламина характеристической группой фосфолипида может быть также холин, инозитол, серин и некоторые другие молекулы.

Рис. ___. Молекулярная структура фосфатидилхолина (=лецитина). Источник изображения: https://pandia.ru/text/80/650/73429-4.php

Мембранная плёночка является двойной, т. е. она состоит из двух липидных плёночек, слипшихся друг с другом с помощью своих липидных «хвостиков». Поэтому в учебниках пишут, что основа клеточной мембраны состоит из двух липидных слоёв (или из «бислоя«, т.е. двойного слоя). У каждого отдельно взятого липидного слоя одна сторона может смачиваться водой, а другая — не может. Так вот, эти плёночки слипаются друг с другом именно своими несмачивающимися сторонами. Примерно так можно соединить две щётки, направив их щетиной друг к другу и слегка придавив.

Мембранные белки

Белки мембраны включены в липидный двойной слой двумя способами:

  1. Гидрофильные радикалы аминокислот поверхностных мембранных белков связаны нековалентными связями с гидрофильной поверхностью липидного бислоя.
  2. Интегральные мембранные белки погружены в гидрофобную область бислоя.

Интегральные белки различаются по степени погруженности в гидрофобную часть бислоя. Они могут располагаться по обеим сторонам мембраны и при этом либо частично погружаются в мембрану, либо располагаются трансмембранно. Погруженная часть интегральных белков содержит большое количество аминокислот с гидрофобными радикалами, которые обеспечивают гидрофобное взаимодействие с липидами мембран. Гидрофобные взаимодействия поддерживают определенную ориентацию белков в мембране. Гидрофильная выступающая часть белка не может переместиться в гидрофобный слой. Часть мембранных белков ковалентно связана с моносахаридными остатками или олигосахаридными цепями и представляет собой гликопротеины. В отличие от нерастворимых фибриллярных белков растворимые белки имеют почти сферическую (глобулярную) форму. Глобулярным белкам свойственна высокоупорядоченная пространственная структура (конформация), которая способствует выполнению специфических биологических функций (Албертс и соавт., 1994).

Подвижными в мембране являются не только липиды, но и мембранные белки. Если белки не закреплены в мембране, они «плавают» в липидном бислое как в жидкости. Поэтому говорят, что биомембраны имеют жидкостно-мозаичную структуру. При этом «дрейф» белков в плоскости мембраны происходит достаточно легко, переход их с внешней стороны мембраны на внутреннюю («флип-флоп») невозможен, а переход липидов происходит крайне редко. Для «перескока» липидов необходимы специальные белки транслокаторы. Исключение составляет жир холестерин, который может легко переходить с одной стороны мембраны на другую. Интегральные мембранные белки имеют трансмембранные спирализованные участки (домены), которые однократно или многократно пересекают липидный бислой. Такие белки прочно связаны с липидным окружением. Периферические мембранные белки удерживаются на мембране с помощью липидного «якоря» и связаны с другими компонентами мембраны; например, они часто бывают ассоциированы с интегральными мембранными белками. У интегральных мембранных белков фрагмент пептидной цепи, пересекающий липидный бислой, обычно состоит из 21–25 преимущественно гидрофобных аминокислот, которые образуют правую трансмембранную α-спираль с 6 или 7 витками (Фалер, Шилдс, 2004).

Мембрана бактерий

Оболочка прокариотической клетки грамотрицательных бактерий состоит из нескольких слоёв, показанных на рисунке ниже.
Слои оболочки грамотрицательных бактерий:
1. Внутренняя трёхслойная цитоплазматическая мембрана, которая соприкасается с цитоплазмой.
2. Клеточная стенка, которая состоит из муреина.
3. Наружная трёхслойная цитоплазматическая мембрана, которая имеет такую же систему липидов с белковыми комплексами, как и внутренняя мембрана.
Общение грамотрицательных бактериальных клеток с внешним миром через такую сложную трёхступенчатую структуру не даёт им преимущества в выживании в суровых условиях по сравнению с грамположительным бактериями, имеющими менее мощную оболочку. Они точно так же плохо переносят высокие температуры, повышенную кислотность и перепады давления.

Рис. Сложная тройная клеточная оболочка грамотрицательных бактерий. Источник изображения: https://probakterii.ru/prokaryotes/organelles/membrana-bakterij.html

 

Рис. Сравнение оболочек грамположительных и грамотрицательных бактерий. Источник изображения: https://myslide.ru/presentation/512325_skachat-stroenie-bakterialnoj-kletki

 

Рис . Рафтовые неоднородности в мембране различного масштаба. а — Нанокластеры холестерола, сфингомиелина, гликосфинголипидов и белков плазматической мембраны различаются по составу. Считается, что в эти кластеры входят ГФИ-заякоренные белки, трансмембранные (ТМ) белки, специфичные для рафтов, и цитоплазматические белки, связанные с актиновыми филаментами. «Обычные» ТМ-белки не входят в состав рафтов. б — В ответ на внешние сигналы нанокластеры могут сливаться с образованием рафтовой платформы, важной для ТМ передачи сигналов и мембранного транспорта. в — Рафтовая фаза, видимая в микроскоп (ø ≈1 мкм), наблюдается исключительно в равновесных мембранных системах, таких как гигантские синтетические или мембранные везикулы. В «нативных» мембранах постоянный обмен веществом и энергией «дробит» рафтовую фазу до субдифракционных размеров…. Читайте дальше на Биомолекуле: https://biomolecula.ru/articles/lipidnyi-fundament-zhizni Источник изображения: https://biomolecula.ru/articles/lipidnyi-fundament-zhizni

 

Рис. Domain-length scales and the biomembrane as a protein–lipid composite material.  (a) Length scales of domains in biomembranes. Shells, complexes and nanoclusters range from 1–10 nm, whereas nanodomains such as caveolae can be as large as 100 nm. (b) A schematic representation of the biomembrane as a composite of lipids and proteins. Estimates of lateral protein concentration are about 30,000 per μm2 based on rhodopsin in the rod outer segment28,29 and transmembrane proteins in the baby hamster kidney (BHK) cell membrane27. Lipids were assumed to occupy a surface area of ∼0.68 nm2 (diameter ∼0.93 nm) and an α-helix ∼1 nm2 (diameter ∼1.1 nm). A 30 × 30 nm2 section of membrane is depicted with 32 lipids on a side, 35 transmembrane proteins with 15 single-span, 12 tetraspan and eight heptaspan α-helical proteins, having assumed crosssectional areas in the plane of the membrane of 1 nm2, 4.5 nm2 and 8 nm2, respectively. Taking into account the area excluded by the proteins, the numerical lipid : protein ratio is ∼50. For a single-span helix with a diameter of ∼1.1 nm, there are about seven lipids in the first boundary layer; for a tetraspan protein with a diameter of ∼2. 4 nm, there are about 11 lipids in the first boundary layer; for a heptaspan protein (such as rhodopsin) with a diameter of ∼3.2 nm, there would be about 14 lipids in the first boundary layer. Such first-boundary layer lipids are shown in white, whereas the second layer is shown in red. All other lipids are shown in yellow. Lipid-binding proteins and adaptors linking transmembrane proteins to membrane proximate cytoskeletal filaments are also depicted as different coloured structures beneath the plane of the membrane, but ectodomains of the membrane proteins are omitted for clarity. Источник изображения: https://www.nature.com/articles/ncb0107-7

 

Видеолекция: Плазматическая мембрана. Е.В. Шеваль, к.б.н.

 

Видеолекция: Мембрана как клеточная граница. А. Иляскин

Видео: История, строение и функции клеточной мембраны: Структура мембран 2 (Владимиров Ю.А.)

Дополнительно: Антонов В.Ф., 1996.

Подробности о биомембранах на сайте Биомолекула

Читать далее:

© 2010-2021 Сазонов В. Ф. © 2010-2016 kineziolog.bodhy.ru, © 2016-2021 kineziolog.su

Клеточная мембрана: ее строение и функции

Что такое клеточная мембрана

  • История исследования клеточной мембраны
  • Свойства и функции клеточной мембраны
  • Строение клеточной мембраны
  • Клеточная мембрана, видео
  • Ни для кого не секрет, что все живые существа на нашей планете состоят их клеток, этих бесчисленных «атомов» органической материи. Клетки же в свою очередь окружены специальной защитной оболочкой – мембраной, играющей очень важную роль в жизнедеятельности клетки, причем функции клеточной мембраны не ограничиваются только лишь защитой клетки, а представляют собой сложнейший механизм, участвующий в размножении, питании, регенерации клетки.

    Что такое клеточная мембрана

    Само слово «мембрана» с латыни переводится как «пленка», хотя мембрана представляет собой не просто своего роду пленку, в которую обернута клетка, а совокупность двух пленок, соединенных между собой и обладающих различными свойствами. На самом деле клеточная мембрана это трехслойная липопротеиновая (жиро-белковая) оболочка, отделяющая каждую клетку от соседних клеток и окружающей среды, и осуществляющая управляемый обмен между клетками и окружающей средой, так звучит академическое определение того что, представляет собой клеточная мембрана.

    Значение мембраны просто огромно, ведь она не просто отделяет одну клетку от другой, но и обеспечивает взаимодействие клетки, как с другими клетками, так и окружающей средой.


    История исследования клеточной мембраны

    Важный вклад в исследование клеточной мембраны был сделан двумя немецкими учеными Гортером и Гренделем в далеком 1925 году. Именно тогда им удалось провести сложный биологический эксперимент над красными кровяными тельцами – эритроцитами, в ходе которых ученые получили так званые «тени», пустые оболочки эритроцитов, которые сложили в одну стопку и измерили площадь поверхности, а также вычислили количество липидов в них. На основании полученного количества липидов ученые пришли к выводу, что их как раз хватаем на двойной слой клеточной мембраны.

    В 1935 году еще одна пара исследователей клеточной мембраны, на этот раз американцы Даниэль и Доусон после целой серии долгих экспериментов установили содержание белка в клеточной мембране. Иначе никак нельзя было объяснить, почему мембрана обладает таким высоким показателем поверхностного натяжения. Ученые остроумно представили модель клеточной мембраны в виде сэндвича, в котором роль хлеба играют однородные липидо-белковые слои, а между ними вместо масла – пустота.

    В 1950 году с появлением электронного микроскопа теорию Даниэля и Доусона удалось подтвердить уже практическими наблюдениями – на микрофотографиях клеточной мембраны были отчетливо видны слои из липидных и белковых головок и также пустое пространство между ними.

    В 1960 году американский биолог Дж. Робертсон разработал теорию о трехслойном строении клеточных мембран, которая долгое время считалась единственной верной, но с дальнейшим развитием науки, стали появляться сомнения в ее непогрешимости. Так, например, с точки зрения термодинамики клеткам было бы сложно и трудозатратно транспортировать необходимые полезные вещества через весь «сэндвич»

    И только в 1972 году американские биологи С. Сингер и Г. Николсон смогли объяснить нестыковки теории Робертсона с помощью новой жидкостно-мозаичной модели клеточной мембраны. В частности они установили что клеточная мембрана не однородна по своему составу, более того – ассиметрична и наполнена жидкостью. К тому же клетки пребывают в постоянном движении. А пресловутые белки, которые входят в состав клеточной мембраны имеют разные строения и функции.

    Рисунок клеточной мембраны.

    Свойства и функции клеточной мембраны

    Теперь давайте разберем, какие функции выполняет клеточная мембрана:

    Барьерная функция клеточной мембраны – мембрана как самый настоящий пограничник, стоит на страже границ клетки, задерживая, не пропуская вредные или попросту неподходящие молекулы

    Транспортная функция клеточной мембраны – мембрана является не только пограничником у ворот клетки, но и своеобразным таможенным пропускным пунктом, через нее постоянно проходит обмен полезными веществами с другими клетками и окружающей средой.

    Матричная функция – именно клеточная мембрана определяет расположение органоидов клетки относительно друг друга, регулирует взаимодействие между ними.

    Механическая функция – отвечает за ограничение одной клетки от другой и параллельно за правильно соединение клеток друг с другом, за формирование их в однородную ткань.

    Защитная функция клеточной мембраны является основой для построения защитного щита клетки. В природе примером этой функции может быть твердая древесина, плотная кожура, защитный панцирь у черепахи, все это благодаря защитной функции мембраны.

    Энергетическая функция – фотосинтез и клеточное дыхание были бы невозможны без участия белка, содержащегося в клеточной мембране. Именно через белковые каналы происходит важный клеточный энергообмен, в этом заключаются самые главные функции белка в клеточной мембране.

    Рецепторная функция – и опять возвращаемся к белкам мембраны, помимо собственно энергообмена они обладают еще одной очень важной функцией – они служат рецепторами клеточной мембраны, благодаря которым клетка получает сигнал от гормонов и нейромедиаторов. Все это необходимо для нормального течения гормональных процессов и проведения нервного импульса.

    Ферментативная функция – еще одна важная функция, осуществляемая некоторыми белками клетки. Например, благодаря этой функции в эпителии кишечника происходит синтез пищеварительных ферментов.

    Также помимо всего этого через клеточную мембрану осуществляется клеточный обмен, который может проходить тремя разными реакциями:

    • Фагоцитоз – это клеточный обмен, при котором встроенные в мембрану клетки-фагоциты захватывают и переваривают различные питательные вещества.
    • Пиноцитоз – представляет собой процесс захвата мембраной клетки, соприкасающиеся с ней молекулы жидкости. Для этого на поверхности мембраны образуются специальные усики, которые как будто окружают каплю жидкости, образуя пузырек, которые впоследствии «проглатывается» мембраной.
    • Экзоцитоз – представляет собой обратный процесс, когда клетка через мембрану выделяет секреторную функциональную жидкость на поверхность.

    Строение клеточной мембраны

    В клеточной мембране имеются липиды трех классов:

    • фосфолипиды (представляются собой комбинацию жиров и фосфора),
    • гликолипиды (представляют собой комбинацию жиров и углеводов),
    • холестерол.

    Фосфолипиды и гликолипиды в свою очередь состоят из гидрофильной головки, в которую отходят два длинных гидрофобных хвостика. Холестерол же занимает пространство между этими хвостиками, не давая им изгибаться, все это в некоторых случаях делает мембрану определенных клеток весьма жесткой. Помимо всего этого молекулы холестерола упорядочивают структуру клеточной мембраны.

    Но как бы там ни было, а самой важной частью строения клеточной мембраны является белок, точнее разные белки, играющие различные важные роли. Несмотря на разнообразие белков содержащихся в мембране есть нечто, что их объединяет – вокруг всех белков мембраны расположены аннулярные липиды. Аннулярные липиды – это особые структурированные жиры, которые служат своеобразной защитной оболочкой для белков, без которой они бы попросту не работали.

    Структура клеточной мембраны имеет три слоя: основу клеточной мембраны составляет однородный жидкий билипидный слой. Белки же покрывают его с обеих сторон наподобие мозаики. Именно белки помимо описанных выше функций также играют роль своеобразных каналов, по которым сквозь мембрану проходят вещества, неспособные проникнуть через жидкий слой мембраны. К таким относятся, например, ионы калия и натрия, для их проникновения через мембрану природой предусмотрены специальные ионные каналы клеточных мембран. Иными словами белки обеспечивают проницаемость клеточных мембран.

    Если смотреть на клеточную мембрану через микроскоп, мы увидим слой липидов, образованный маленькими шарообразными молекулами по которому плавают словно по морю белки. Теперь вы знаете, какие вещества входят в состав клеточной мембраны.

    Клеточная мембрана, видео

    И в завершение образовательное видео о клеточной мембране.

    Автор: Павел Чайка, главный редактор журнала Познавайка

    При написании статьи старался сделать ее максимально интересной, полезной и качественной. Буду благодарен за любую обратную связь и конструктивную критику в виде комментариев к статье. Также Ваше пожелание/вопрос/предложение можете написать на мою почту [email protected] или в Фейсбук, с уважением автор.

    Эта статья доступна на английском языке – Cell Membrane.

    Клеточная мембрана

    Клеточная мембрана

    Клеточная мембрана также называется плазматической (или цитоплазматической) мембраной и плазмалеммой. Данная структура не только отделяет внутреннее содержимое клетки от внешней среды, но также входит с состав большинства клеточных органелл и ядра, в свою очередь отделяя их от гиалоплазмы (цитозоля) — вязко-жидкой части цитоплазмы. Договоримся называть цитоплазматической мембраной ту, которая отделяет содержимое клетки от внешней среды. Остальными терминами обозначать все мембраны.

    Строение клеточной мембраны

    В основе строения клеточной (биологической) мембраны лежит двойной слой липидов (жиров). Формирование такого слоя связано с особенностями их молекул. Липиды не растворяются в воде, а по-своему в ней конденсируются. Одна часть отдельно взятой молекулы липида представляет собой полярную головку (она притягивается водой, т. е. гидрофильна), а другая — пару длинных неполярных хвостов (эта часть молекулы отталкивается от воды, т. е. гидрофобна). Такое строение молекул заставляет их «прятать» хвосты от воды и поворачивать к воде свои полярные головки.

    В результате образуется двойной липидный слой, в котором неполярные хвосты находятся внутри (обращены друг к другу), а полярные головки обращены наружу (к внешней среде и цитоплазме). Поверхность такой мембраны гидрофильна, а внутри она гидрофобна.

    В клеточных мембранах среди липидов преобладают фосфолипиды (относятся к сложным липидам). Их головки содержат остаток фосфорной кислоты. Кроме фосфолипидов есть гликолипиды (липиды + углеводы) и холестерол (относится к стеролам). Последний придает мембране жесткость, размещаясь в ее толще между хвостами остальных липидов (холестерол полностью гидрофобный).

    За счет электростатического взаимодействия, к заряженным головкам липидов присоединяются некоторые молекулы белков, которые становятся поверхностными мембранными белками. Другие белки взаимодействуют с неполярными хвостами, частично погружаются в двойной слой или пронизывают его насквозь.

    Таким образом, клеточная мембрана состоит из двойного слоя липидов, поверхностных (периферических), погруженных (полуинтегральных) и пронизывающих (интегральных) белков. Кроме того, некоторые белки и липиды с внешней стороны мембраны связаны с углеводными цепями.

    Это жидкостно-мозаичная модель строения мембраны была выдвинута в 70-х годах XX века. До этого предполагалась бутербродная модель строения, согласно которой липидный бислой находится внутри, а с внутренней и наружной стороны мембрана покрыта сплошными слоями поверхностных белков. Однако накопление экспериментальных данных опровергло эту гипотезу.

    Толщина мембран у разных клеток составляет около 8 нм. Мембраны (даже разные стороны одной) отличаются между собой по процентному соотношению различных видов липидов, белков, ферментативной активности и др. Какие-то мембраны более жидкие и более проницаемые, другие более плотные.

    Разрывы клеточной мембраны легко сливаются из-за физико-химических особенностей липидного бислоя. В плоскости мембраны липиды и белки (если только они не закреплены цитоскелетом) перемещаются.

    Функции клеточной мембраны

    Большинство погруженных в клеточную мембрану белков выполняют ферментативную функцию (являются ферментами). Часто (особенно в мембранах органоидов клетки) ферменты располагаются в определенной последовательности так, что продукты реакции, катализируемые одним ферментом, переходят ко второму, затем третьему и т. д. Образуется конвейер, который стабилизируют поверхностные белки, т. к. не дают ферментам плавать вдоль липидного бислоя.

    Клеточная мембрана выполняет отграничивающую (барьерную) от окружающей среды и в то же время транспортную функции. Можно сказать, это ее самое главное назначение. Цитоплазматическая мембрана, обладая прочностью и избирательной проницаемостью, поддерживает постоянство внутреннего состава клетки (ее гомеостаз и целостность).

    При этом транспорт веществ происходит различными способами. Транспорт по градиенту концентрации предполагает передвижение веществ из области с их большей концентрацией в область с меньшей (диффузия). Так, например, диффундируют газы (CO2, O2).

    Бывает также транспорт против градиента концентрации, но с затратой энергии.

    Транспорт бывает пассивным и облегченным (когда ему помогает какой-нибудь переносчик). Пассивная диффузия через клеточную мембрану возможна для жирорастворимых веществ.

    Есть особые белки, делающие мембраны проницаемыми для сахаров и других водорастворимых веществ. Такие переносчики соединяются с транспортируемыми молекулами и протаскивают их через мембрану. Так переносится глюкоза внутрь эритроцитов.

    Пронизывающие белки, объединяясь, могут образовывать пору для перемещения некоторых веществ через мембрану. Такие переносчики не перемещаются, а образуют в мембране канал и работают аналогично ферментам, связывая определенное вещество. Перенос осуществляется благодаря изменению конформации белка, благодаря чему в мембране образуются каналы. Пример — натрий-калиевый насос.

    Транспортная функция клеточной мембраны эукариот также реализуется за счет эндоцитоза (и экзоцитоза). Благодаря этим механизмам в клетку (и из нее) попадают крупные молекулы биополимеров, даже целые клетки. Эндо- и экзоцитоз характерны не для всех клеток эукариот (у прокариот его вообще нет). Так эндоцитоз наблюдается у простейших и низших беспозвоночны; у млекопитающих лейкоциты и макрофаги поглощают вредные вещества и бактерии, т. е. эндоцитоз выполняет защитную функцию для организма.

    Эндоцитоз делится на фагоцитоз (цитоплазма обволакивает крупные частицы) и пиноцитоз (захват капелек жидкости с растворенными в ней веществами). Механизм этих процессов приблизительно одинаков. Поглощаемые вещества на поверхности клеток окружаются мембраной. Образуется пузырек (фагоцитарный или пиноцитарный), который затем перемещается внутрь клетки.

    Экзоцитоз — это выведение цитоплазматической мембраной веществ из клетки (гормонов, полисахаридов, белков, жиров и др.). Данные вещества заключаются в мембранные пузырьки, которые подходят к клеточной мембране. Обе мембраны сливаются и содержимое оказывается за пределами клетки.

    Цитоплазматическая мембрана выполняет рецепторную функцию. Для этого на ее внешней стороне располагаются структуры, способные распознавать химический или физический раздражитель. Часть пронизывающих плазмалемму белков с наружней стороны соединены с полисахаридными цепочками (образуя гликопротеиды). Это своеобразные молекулярные рецепторы, улавливающие гормоны. Когда конкретный гормон связывается со своим рецептором, то изменяет его структуру. Это в свою очередь запускает механизм клеточного ответа. При этом могут открываться каналы, и в клетку могут начать поступать определенные вещества или выводиться из нее.

    Рецепторная функция клеточных мембран хорошо изучена на основе действия гормона инсулина. При связывании инсулина с его рецептором-гликопротеидом происходит активация каталитической внутриклеточной части этого белка (фермента аденилатциклазы). Фермент синтезирует из АТФ циклическую АМФ. Уже она активирует или подавляет различные ферменты клеточного метаболизма.

    Рецепторная функция цитоплазматической мембраны также включает распознавание соседних однотипных клеток. Такие клетки прикрепляются друг к другу различными межклеточными контактами.

    В тканях с помощью межклеточных контактов клетки могут обмениваться между собой информацией с помощью специально синтезируемых низкомолекулярных веществ. Одним из примеров подобного взаимодействия является контактное торможение, когда клетки прекращают рост, получив информацию, что свободное пространство занято.

    Межклеточные контакты бывают простыми (мембраны разных клеток прилегают друг к другу), замковыми (впячивания мембраны одной клетки в другую), десмосомы (когда мембраны соединены пучками поперечных волокон, проникающих в цитоплазму). Кроме того, есть вариант межклеточных контактов за счет медиаторов (посредников) — синапсы. В них сигнал передается не только химическим, но и электрическим способом. Синапсами передаются сигналы между нервными клетками, а также от нервных к мышечным.

    Источник:
    http://biology.su/cytology/cell-membrane

    Что такое клеточная мембрана

    Клеточная стенка, если таковая у клетки имеется (обычно есть у растительных клеток), покрывает клеточную мембрану.

    Клеточная мембрана представляет собой двойной слой (бислой) молекул класса липидов, большинство из которых представляет собой так называемые сложные липиды — фосфолипиды. Молекулы липидов имеют гидрофильную («головка») и гидрофобную («хвост») часть. При образовании мембран гидрофобные участки молекул оказываются обращены внутрь, а гидрофильные — наружу. Мембраны — структуры инвариабельные, весьма сходные у разных организмов. Некоторое исключение составляют, пожалуй, археи, у которых мембраны образованы глицерином и терпеноидными спиртами. Толщина мембраны составляет 7—8 нм.

    Биологическая мембрана включает и различные белки: интегральные (пронизывающие мембрану насквозь), полуинтегральные (погруженные одним концом во внешний или внутренний липидный слой), поверхностные (расположенные на внешней или прилегающие к внутренней сторонам мембраны). Некоторые белки являются точками контакта клеточной мембраны с цитоскелетом внутри клетки, и клеточной стенкой (если она есть) снаружи. Некоторые из интегральных белков выполняют функцию ионных каналов, различных транспортеров и рецепторов.

    Функции

    • барьерная — обеспечивает регулируемый, избирательный, пассивный и активный обмен веществ с окружающей средой. Например, мембрана пероксисом защищает цитоплазму от опасных для клетки пероксидов. Избирательная проницаемость означает, что проницаемость мембраны для различных атомов или молекул зависит от их размеров, электрического заряда и химических свойств. Избирательная проницаемость обеспечивает отделение клетки и клеточных компартментов от окружающей среды и снабжение их необходимыми веществами.
    • транспортная — через мембрану происходит транспорт веществ в клетку и из клетки. Транспорт через мембраны обеспечивает: доставку питательных веществ, удаление конечных продуктов обмена, секрецию различных веществ, создание ионных градиентов, поддержание в клетке оптимального pH и концентрации ионов, которые нужны для работы клеточных ферментов.
      Частицы, по какой-либо причине неспособные пересечь фосфолипидный бислой (например, из-за гидрофильных свойств, так как мембрана внутри гидрофобна и не пропускает гидрофильные вещества, или из-за крупных размеров), но необходимые для клетки, могут проникнуть сквозь мембрану через специальные белки-переносчики (транспортеры) и белки-каналы или путем эндоцитоза.
      При пассивном транспорте вещества пересекают липидный бислой без затрат энергии по градиенту концентрации путем диффузии. Вариантом этого механизма является облегчённая диффузия, при которой веществу помогает пройти через мембрану какая-либо специфическая молекула. У этой молекулы может быть канал, пропускающий вещества только одного типа.
      Активный транспорт требует затрат энергии, так как происходит против градиента концентрации. На мембране существуют специальные белки-насосы, в том числе АТФаза, которая активно вкачивает в клетку ионы калия (K+) и выкачивают из неё ионы натрия (Na+).
    • матричная — обеспечивает определенное взаиморасположение и ориентацию мембранных белков, их оптимальное взаимодействие.
    • механическая — обеспечивает автономность клетки, ее внутриклеточных структур, также соединение с другими клетками (в тканях). Большую роль в обеспечение механической функции имеют клеточные стенки, а у животных — межклеточное вещество.
    • энергетическая — при фотосинтезе в хлоропластах и клеточном дыхании в митохондриях в их мембранах действуют системы переноса энергии, в которых также участвуют белки;
    • рецепторная — некоторые белки, находящиеся в мембране, являются рецепторами (молекулами, при помощи которых клетка воспринимает те или иные сигналы).
      Например, гормоны, циркулирующие в крови, действуют только на такие клетки-мишени, у которых есть соответствующие этим гормонам рецепторы. Нейромедиаторы (химические вещества, обеспечивающие проведение нервных импульсов) тоже связываются с особыми рецепторными белками клеток-мишеней.
    • ферментативная — мембранные белки нередко являются ферментами. Например, плазматические мембраны эпителиальных клеток кишечника содержат пищеварительные ферменты.
    • осуществление генерации и проведения биопотенциалов.
      С помощью мембраны в клетке поддерживается постоянная концентрация ионов: концентрация иона К+ внутри клетки значительно выше, чем снаружи, а концентрация Na+ значительно ниже, что очень важно, так как это обеспечивает поддержание разности потенциалов на мембране и генерацию нервного импульса.
    • маркировка клетки — на мембране есть антигены, действующие как маркеры — «ярлыки», позволяющие опознать клетку. Это гликопротеины (то есть белки с присоединенными к ним разветвленными олигосахаридными боковыми цепями), играющие роль «антенн». Из-за бесчисленного множества конфигурации боковых цепей возможно сделать для каждого типа клеток свой особый маркер. С помощью маркеров клетки могут распознавать другие клетки и действовать согласованно с ними, например, при формировании органов и тканей. Это же позволяет иммунной системе распознавать чужеродные антигены.

    Структура и состав биомембран

    Мембраны состоят из липидов трёх классов: фосфолипиды, гликолипиды и холестерол. Фосфолипиды и гликолипиды (липиды с присоединёнными к ним углеводами) состоят из двух длинных гидрофобных углеводородных «хвостов», которые связаны с заряженной гидрофильной «головой». Холестерол придаёт мембране жёсткость, занимая свободное пространство между гидрофобными хвостами липидов и не позволяя им изгибаться. Поэтому мембраны с малым содержанием холестерола более гибкие, а с большим — более жёсткие и хрупкие. Также холестерол служит «стопором», препятствующим перемещению полярных молекул из клетки и в клетку. Важную часть мембраны составляют белки, пронизывающие её и отвечающие за разнообразные свойства мембран. Их состав и ориентация в разных мембранах различаются.

    Клеточные мембраны часто асимметричны, то есть слои отличаются по составу липидов, переход отдельной молекулы из одного слоя в другой (так называемый флип-флоп) затруднён.

    Мембранные органеллы

    Это замкнутые одиночные или связанные друг с другом участки цитоплазмы, отделённые от гиалоплазмы мембранами. К одномембранным органеллам относятся эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, лизосомы, вакуоли, пероксисомы; к двумембранным — ядро, митохондрии, пластиды. Строение мембран различных органелл отличается по составу липидов и мембранных белков.

    Избирательная проницаемость

    Клеточные мембраны обладают избирательной проницаемостью: через них медленно диффундируют глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты, глицерол и ионы, причем сами мембраны в известной мере активно регулируют этот процесс — одни вещества пропускают, а другие нет. Существует четыре основных механизма для поступления веществ в клетку или вывода их из клетки наружу: диффузия, осмос, активный транспорт и экзо- или эндоцитоз. Два первых процесса носят пассивный характер, то есть не требуют затрат энергии; два последних — активные процессы, связанные с потреблением энергии.

    Избирательная проницаемость мембраны при пассивном транспорте обусловлена специальными каналами — интегральными белками. Они пронизывают мембрану насквозь, образовывая своего рода проход. Для элементов K, Na и Cl есть свои каналы. Относительно градиента концентрации молекулы этих элементов движутся в клетку и из неё. При раздражении каналы натриевых ионов раскрываются, и происходит резкое поступление в клетку ионов натрия. При этом происходит дисбаланс мембранного потенциала. После чего мембранный потенциал восстанавливается. Каналы калия всегда открыты, через них в клетку медленно попадают ионы калия.

    Источник:
    http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/970083

    Клеточная мембрана. Функции клеточной мембраны. Строение клеточной мембраны.

    Содержание статьи

    Клеточная мембрана

    Клеточная мембрана или цитолемма или плазмалемма или плазматическая мембрана – эластическая молекулярная структура. Её толщина составляет от 6 до 10 нм. Рассматривая строение клеточной мембраны, можно сказать, что она состоит из белков (около 40%) и липидов (около 60%).

    Функции клеточной мембраны

    По функциональным особенностям клеточную мембрану можно разделить на 9 выполняемых ей функций.
    Функции клеточной мембраны:
    1. Транспортная. Производит транспорт веществ из клетки в клетку;
    2. Барьерная. Обладает избирательной проницаемостью, обеспечивает необходимый обмен веществ;
    3. Рецепторная. Некоторые белки находящиеся в мембране являются рецепторами;
    4. Механическая. Обеспечивает автономность клетки и её механических структур;
    5. Матричная. Обеспечивает оптимальное взаимодействие и ориентацию матричных белков;
    6. Энергетическая. В мембранах действуют системы переноса энергии при клеточном дыхании в митохондриях;
    7. Ферментативная. Мембранные белки иногда являются ферментами. Например мембраны клеток кишечника;
    8. Маркировочная. На мембране есть антигены (гликопротеины), которые позволяют опознать клетку;
    9. Генерирующая. Осуществляет генерацию и проведение биопотенциалов.

    Посмотреть как выглядит клеточная мембрана можно на примере строения животной клетки или растительной клетки.

    Cтроение клеточной мембраны

    На рисунке приведено строение клеточной мембраны.
    К компонентам клеточной мембраны можно отнести различные белки клеточной мембраны (глобулярный, переферический, поверхностный), а также липиды клеточной мембраны (гликолипид, фосфолипид). Таже в строении клеточной мембраны присутствуют углеводы, холестерол, гликопротеин и белковая альфа спираль.

    Состав клеточной мембраны

    К основному составу клеточной мембраны относятся:
    1. Белки – отвечающие за разнообразные свойства мембраны;
    2. Липиды трёх видов (фосфолипиды, гликолипиды и холестерол) отвечающих за жёсткость мембраны.
    Белки клеточной мембраны:
    1. Глобулярный белок;
    2. Поверхностный белок;
    3. Переферический белок.

    Основное назначение клеточной мембраны

    Основное назначение клеточной мембраны:
    1. Регулировать обмен между клеткой и средой;
    2. Отделять содержимое любой клетки от внешней среды тем самым обеспечивая её целостность;
    3. Внутриклеточные мембраны разделяют клетку на специализированные замкнутые отсеки – органеллы или компартменты, в которых поддерживаются определённые условия среды.

    Структура клеточной мембраны

    Структура клеточной мембраны представляют собой двумерный раствор глобулярных интегральных белков, растворенных в жидком фосфолипидном матриксе. Данная модель мембранной структуры была предложена двумя учёными Никольсоном и Сингером в 1972 году. Таким образом, основу мембран составляет бимолекулярный липидный слой, с упорядоченным расположением молекул, что вы могли видеть на этом рисунке.

    Источник:
    http://www.new-era.me/articles/kletochnaya-membrana-funkcii-stroenie.php

    Мембрана строение функция

    Мембрана строение функция

    Основная структурная единица живого организма — клетка, являющаяся дифференцированным участком цитоплазмы, окружённым клеточной мембраной. Ввиду того что клетка выполняет множество важнейших функций, таких, как размножение, питание, движение, оболочка должна быть пластичной и плотной.

    История открытия и исследования клеточной мембраны

    В 1925 году Гренделем и Гордером был поставлен успешный эксперимент по выявлению «теней|теней» эритроцитов, или пустых оболочек. Несмотря на несколько допущенных грубых ошибок, учёными было произведено открытие липидного бислоя. Их труды продолжили Даниэлли, Доусон в 1935 году, Робертсон в 1960 году. В результате многолетней работы и накопления аргументов в 1972 году Сингер и Николсон создали жидкостно-мозаичную модель строения мембраны. Дальнейшие опыты и исследования подтвердили труды учёных.

    Что же представляет собой клеточная мембрана? Это слово стало использоваться более ста лет назад, в переводе с латинского оно означает «плёнка», «кожица». Так обозначают границу клетки, являющуюся естественным барьером между внутренним содержимым и внешней средой. Строение клеточной мембраны предполагает полупроницаемость, благодаря которой влага и питательные вещества и продукты распада свободно могут проходить сквозь неё. Эту оболочку можно назвать основной структурной составляющей организации клетки.

    Рассмотрим основные функции клеточной мембраны

    1. Разделяет внутреннее содержимое клетки и компоненты внешней среды|среды.

    2. Способствует поддержанию постоянного химического состава клетки.

    3. Регулирует правильный обмен веществ.

    4. Обеспечивает взаимосвязь между клетками.

    5. Распознает|Распознаёт сигналы.

    6. Функция защиты.

    Наружная клеточная мембрана, называемая также плазменной, представляет собой ультрамикроскопическую плёнку, толщина которой составляет от пяти до семи наномиллиметров. Она состоит преимущественно из белковых соединений, фосфолидов, воды|воды. Плёнка является эластичной, легко впитывает воду, а также стремительно восстанавливает свою целостность после повреждений.

    Отличается универсальным строением. Эта мембрана занимает пограничное положение, участвует в процессе избирательной проницаемости, выведении продуктов распада, синтезирует их. Взаимосвязь с «соседями» и надёжная защита внутреннего содержимого от повреждения делает её важной составляющей в таком вопросе, как строение клетки. Клеточная мембрана животных организмов иногда оказывается покрытой тончайшим слоем – гликокаликсом, в состав которого входят белки|белки и полисахариды. Растительные клетки снаружи от мембраны защищены клеточной стенкой, выполняющей функции опоры и поддержания формы. Основной компонент её состава – это клетчатка (целлюлоза) – полисахарид, не растворимый в воде.

    Таким образом, наружная клеточная мембрана выполняет функцию восстановления, защиты и взаимодействия с другими клетками.

    Строение клеточной мембраны

    Толщина этой подвижной|подвижной оболочки варьируется в пределах от шести до десяти наномиллиметров. Клеточная мембрана клетки имеет особый состав, основой которого служит липидный бислой. Гидрофобные хвосты, инертные к воде, размещены с внутренней стороны|стороны, в то время как гидрофильные головки, взаимодействующие с водой, обращены наружу. Каждый липид представляет фосфолипид, который является результатом взаимодействия таких веществ, как глицерин и сфингозин. Липидный каркас тесно окружают белки|белки, которые расположены несплошным слоем. Некоторые из них погружены в липидный слой, остальные проходят сквозь него. В результате этого образуются проницаемые для воды|воды участки. Выполняемые этими белками|белками функции различны. Некоторые из них являются ферментами, остальные — транспортными белками|белками, которые переносят различные вещества из внешней среды|среды на цитоплазму и обратно.

    Клеточная мембрана насквозь пронизана и тесно связана интегральными белками|белками, а с переферическими связь менее прочная. Эти белки|белки выполняют важную функцию, которая заключается в поддержании структуры мембраны, получении и преобразовании сигналов из окружающей среды|среды, транспорте веществ, катализации реакций, которые происходят на мембранах.

    Состав

    Основу клеточной мембраны представляет бимолекулярный слой. Благодаря его непрерывности клетка имеет барьерное и механическое свойства. На разных этапах жизнедеятельности данный бислой может нарушиться. Вследствие этого образуются структурные дефекты сквозных гидрофильных пор. В таком случае могут изменяться абсолютно всё|все функции такой составляющей, как клеточная мембрана. Ядро при этом может пострадать от внешних воздействий.

    Свойства

    Клеточная мембрана клетки имеет интересные особенности. Благодаря текучести эта оболочка не является жёсткой структурой, а основная часть белков и липидов, которые входят в её состав, свободно перемещается на плоскости мембраны.

    В целом клеточная мембрана асимметрична, поэтому состав белковых и липидных слоёв различается. Плазматические мамбраны в животных клетках со своей наружной стороны|стороны имеют гликопротеиновый слой, который выполняет рецепторные и сигнальные функции, а также играет большую|большую роль в процессе объединения клеток в ткань. Клеточная мембрана является полярной, то есть на внешней стороне заряд положителен, а с внутренней стороны|стороны – отрицателен. Помимо всего перечисленного, оболочка клетки обладает избирательной проницательностью. Это означает, что кроме воды|воды в клетку пропускается только определённая группа молекул и ионов растворившихся веществ. Концентрация такого вещества, как натрий, в большинстве клеток значительно ниже, чем во внешней среде. Для ионов калия характерно другое соотношение: их количество в клетке намного выше, чем в окружающей среде. В связи с этим ионам натрия присуще стремление проникнуть в клеточную оболочку, а ионы калия стремятся освободиться наружу. При данных обстоятельствах мембрана активизирует особую систему, выполняющую «насосную» роль, выравнивая концентрацию веществ: ионы натрия откачиваются на поверхность клетки, а ионы калия накачиваются внутрь. Данная особенность входит в важнейшие функции клеточной мембраны.

    Подобное стремление ионов натрия и калия переместиться внутрь с поверхности играет большую|большую роль в вопросе транспортировки сахара|сахара|сахара и аминокислот в клетку. В процессе активного удаления ионов натрия из клетки мембрана создаёт условия для новых поступлений глюкозы и аминокислот внутрь. Напротив, в процессе переноса ионов калия внутрь клетки пополняется число «транспортировщиков» продуктов распада изнутри клетки во внешнюю среду|среду.

    Как происходит питание клетки через клеточную мембрану?

    Многие клетки поглощают вещества посредством таких процессов, как фагоцитоз и пиноцитоз. При первом варианте гибкой наружной мембраной создаётся маленькое углубление, в котором оказывается захватываемая частица. Затем диаметр углубления становится больше, пока окружённая частица не попадёт в клеточную цитоплазму. Посредством фагоцитоза подпитываются некоторые простейшие, например амёбы, а также кровяные тельца|тельца — лейкоциты и фагоциты. Аналогичным образом клетки поглощают жидкость, которая содержит необходимые полезные вещества. Такое являние носит название пиноцитоз.

    Наружная мембрана тесно соединена с эндоплазматической сетью клетки.

    У многих типов основных составляющих ткани на поверхности мембраны расположены выступы, складки, микроворсинки. Растительные клетки снаружи этой оболочки покрыты ещё одной, толстой и отчётливо различимой в микроскоп. Клетчатка, из которой они состоят, помогает формировать опору тканям растительного происхождения, например, древесину. Клетки животных также обладают рядом внешних структур, которые находятся поверх клеточной мембраны. Они носят исключительно защитный характер, пример тому – хитин, содержащийся в покровных клетках насекомых.

    Помимо клеточной, существует внутриклеточная мембрана. Её функция заключается в разделении клетки на несколько специализированных замкнутых отсеков – компартментов или органелл, где должна поддерживаться определённая среда.

    Таким образом, невозможно переоценить роль такой составляющей основной единицы живого организма, как клеточная мембрана. Строение и функции предполагают значительное расширение общей площади поверхности клетки, улучшение обменных процессов. В состав этой молекулярной структуры входят белки|белки и липиды. Отделяя клетку от внешней среды|среды, мембрана обеспечивает её целостность. С её помощью межклеточные связи поддерживаются на достаточно крепком уровне, образовывая ткани. В связи с этим можно сделать вывод, что одну из важнейших ролей|ролей в клетке играет клеточная мембрана. Строение и функции, выполняемые ею, радикально отличаются в различных клетках, в зависимости от их предназначения. Посредством этих особенностей достигается разнообразие физиологической активности клеточных оболочек и их ролей|ролей в существовании клеток и тканей.

    Мембрана строение функция

    Природа создала множество организмов и клеток, но, несмотря на это, строение и большая|большая часть функций биологических мембран одинаковы, что позволяет рассматривать их структуру и изучать их ключевые свойства без привязанности к конкретному виду клеток.

    Что такое мембрана?

    Мембраны – это защитный элемент, который является неотъемлемой составляющей клетки любого живого организма.

    Структурной и функциональной единицей всех живых организмов на планете является клетка. Жизнедеятельность её неразрывно связана с окружающей средой, с которой она обменивается энергией, информацией, веществом. Так, питательная энергия, необходимая для функционирования клетки, поступает извне и тратится на осуществление ею различных функций.

    Структура простейшей единицы строения живого организма: мембрана клетки, ядро, органеллы, разнообразные включения. Она окружена мембраной, внутри которой располагается ядро и всё|все органеллы. Это митохондрии, лизосомы, рибосомы, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум. Каждый структурный элемент имеет свою мембрану.

    Роль в жизнедеятельности клетки

    Биологическая мембрана играет кульминационную роль в строении и функционировании элементарной живой системы. Только клетка, окружённая защитной оболочкой, по праву может называться организмом. Такой процесс, как обмен веществ, также осуществляется благодаря наличию мембраны. Если структурная целостность её нарушена, это приводит к изменению функционального состояния организма в целом.

    Клеточная мембрана и её функции

    Она отделяет цитоплазму клетки от внешней среды|среды или от оболочки. Мембрана клетки обеспечивает должное выполнение специфических функций, специфику межклеточных контактов и иммунных проявлений, поддерживает трансмембранную разницу электрического потенциала. В ней имеются рецепторы, способные воспринимать химические сигналы – гормоны, медиаторы и другие биологические активные компоненты. Эти рецепторы наделяют её ещё одной способностью – изменять метаболическую активность клетки.

    1. Активный перенос веществ.

    2. Пассивный перенос веществ:

    2.1. Диффузия простая.

    2.2. Перенос через поры|поры.

    2.3. Транспорт, осуществляемый за счёт диффузии переносчика вместе с мембранным веществом или посредством передачи по эстафете вещества по молекулярной цепи переносчика.

    3. Перенос неэлектролитов благодаря простой и облегчённой диффузии.

    4. Активный транспорт ионов.

    Строение мембраны клетки

    Составляющие мембраны клетки – липиды и белки|белки.

    Липиды: фосфолипиды, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилинозит и фосфатидилсерин, гликолипиды. Доля липидов составляет 40-90 %.

    Белки|Белки: периферические, интегральные (гликопротеины), спектрин, актин, цитоскелет.

    Основной структурный элемент – двойной слой фосфолипидных молекул.

    Кровельная мембрана: определение и типология

    Немного статистики. На территории Российской Федерации мембрана в качестве кровельного материала используется не так уж и давно. Удельный вес мембранных кровель из общего числа|числа мягких перекрытий крыш составляет всего 1,5 %. Более широкое распространение в России получили битумные и мастичные кровли. А вот в Западной Европе на долю мембранных кровель приходится 87 %. Разница ощутимая.

    Как правило, мембрана в роли основного материала при перекрытии крыши идеально подходит для плоских кровель. Для имеющих большой уклон она подходит в меньшей степени.

    Объёмы производства и реализации мембранных кровель на отечественном рынке имеют положительную тенденцию роста|роста. Почему? Причины более чем ясны:

    • Срок эксплуатации составляет около 60 лет. Представьте себе, только гарантийный срок использования, который устанавливается производителем, достигает 20 лет.
    • Лёгкость в монтаже. Для сравнения: установка битумной кровли занимает в 1,5 раза больше времени, нежели монтаж мембранного перекрытия.
    • Простота в обслуживании и проведении ремонтных работ.

    Толщина кровельных мембран может составлять 0,8-2 мм, а средний показатель веса|веса одного метра квадратного равен 1,3 кг.

    Свойства кровельных мембран:

    Мембрана кровельная бывает трёх типов. Главный классификационный признак – вид полимерного материала, составляющего основание полотна|полотна. Итак, кровельные мембраны бывают:

    Мембрана профилированная: характеристика, функции и преимущества

    Профилированные мембраны – это инновация на строительном рынке. Такая мембрана эксплуатируется в качестве гидроизоляционного материала.

    Вещество, используемое при изготовлении, – полиэтилен. Последний бывает двух типов: полиэтилен высокого давления (ПВД) и полиэтилен низкого давления (ПНД).

    Техническая характеристика мембраны из ПВД и ПНД

    Источник:
    http://biologyinfo.ru/page/membrana-stroenie-funkcija/

    СПАДИЛО.РУ

    теория по биологии цитология

    Теория для подготовки к блоку «Цитология»

    Клеточная мембрана

    Мембрана клетки = цитоплазматическая мембрана = плазматическая мембрана = плазмалемма

    Образована двумя слоями фосфолипидов, которые имеют гидрофильные головки и гидрофобные хвосты. Головки расположены в сторону жидких сред: цитоплазма и внеклеточное вещество/ вещество окружающей среды, а хвосты – друг к другу. Так клеточная мембрана является достаточно плотной структурой, но в то же время пластичной и подвижной. Билипидный слой не дает содержимому клетки растекаться, а также препятствует проникновению внутрь клетки веществ, способных нанести ей вред.

    Строение клеточной мембраны

    Мембрана клеток частично проницаема. Это значит, что любое вещество не может в нее проникнуть, однако и закрытой ее назвать нельзя. Так как существуют константы гомеостаза (гомеостаз – постоянство внутренней среды), определяющие содержание веществ внутри клетки, то клетка выводит ненужные ей вещества и пропускает нужные. Для этого в клетках есть разные приспособления:

    Белки-рецепторы для того, чтобы узнавать молекулы веществ, приближающихся к клетке.

    Белки, образующие «тоннели» в клеточной мембране для пассивного тока воды и некоторых неорганических ионов.

    Клеточная мембрана помимо выборочной проницаемости обладает свойством текучести. Для захвата пищевых частиц мембрана клетки впячивается, края этого участка мембраны как бы обнимают пищу. Потом края замыкаются и пища в пищевом пузырьке, который называется фагосомой, направляется в пищеварительную вакуоль, где специальные белки-ферменты расщепят пищу. Процесс захвата клеткой твердой пищи называется фагоцитозом. Если же клетка поглощает капельку, то процесс называется пиноцитозом, а пузырек, в котором капля транспортируется в вакуоль – везикулой. Когда клетка заканчивает свои пищеварительные процессы, то ей, как и многоклеточному сложному организму, нужно вывести наружу непереваренные остатки. Тогда происходит экзоцитоз (приставка «экзо-» означает наружу), процесс обратный фагоцитозу.

    Мембрана клетки не представляет их себя непрерывную цепь липидов, она имеет включения в виде белков разных конфигураций. Они могут быть на поверхности мембраны, проходить сквозь нее, образовывать каналы, находиться в наружном или внутреннем слое липидов.

    Во-первых, это отличительная черта эукариотических организмов. Ядро управляет процессами внутри клетки, а также хранит генетическую информацию, которая передается по наследству.

    Мембрана ядра состоит из двух оболочек, пронизанных ядерными порами. Внешняя оболочка ядра шероховатая, она связана с эндоплазматической сетью клетки.

    Строение ядра. * Ядерный сок = кариоплазма.

    Через поры тРНК и иРНК выходят в цитоплазму клетки. Тем временем, пока клетка не делится, в ядре располагаются деспирализованные молекулы ДНК, или же хроматин. Хроматином называются молекулы ДНК, которые связаны с белками. В профазе митоза и в профазе первого деления мейоза хроматин спирализуется, то есть наматывается на специальные гистоновые белки как проволока на карандаш. В таком виде ДНК становится компактной. В интерфазе можно увидеть огромные политенные хромосомы. Они настолько большие, что их прекрасно можно рассмотреть и в обычный световой микроскоп, однако образуются такие хромосомы далеко не во всех клетках. 1 хромосома образована 1 молекулой ДНК. Хромосомы могут быть однохроматидными и двухроматидными. Как раз-таки двухроматидными, состоящими из 2х сестринских хроматид, хромосомы становятся после процесса репликации. В центре такие хромосомы соединены особой перетяжкой – центромерой. Каждая хроматида имеет по два плеча, они могут быть разной длины, а могут быть одинаковой. На концах хроматид располагаются теломеры. Интересный факт: старением организма связано с укорачиванием теломер с течением жизни.

    Строение двухроматидной хромосомы

    Внутрь клетки проникают неорганические ионы, АТФ, белки и ферменты и т.д. В ядре есть жидкая составляющая, как в клетке, кариоплазма. А в кариоплазме – ядрышки, в которых происходит синтез частей рибосом. В цитоплазме формируются целые рибосомы. В одном ядре могут находиться от 1 до 7 ядрышек, образованных близкими по отношению друг к другу петлями ДНК.

    Обычно в клетках располагается одно ядро, но бывают и исключения: эритроциты в ходе созревания утрачивают свое ядро, а клетки мышечной ткани – миоциты, наоборот имеют много ядер.

    Источник:
    http://spadilo.ru/kletochnaya-membrana-i-yadro/

    21. Наружная мембрана

    19.
    Внутренние мембраны клетки, несмотря
    на различия в морфологическом и
    функциональном отношениях, представляют
    собой единое целое, поскольку способны
    переходить друг в друга в процессе
    функционирования клетки как будет
    показано ниже. К вакуолярной системе
    относятся МЕМБРАНЫ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО
    РЕТИКУЛУМА, АППАРАТА ГОЛЬДЖИ, МИКРОТЕЛЬЦА,
    ЛИЗОСОМЫ и ВАКУОЛИ РАСТИТЕЛЬНОЙ
    КЛЕТКИ. 

    Мембраны
    эндоплазматического ретикулума являются
    крайне сложным и разветвленным
    продолжением внешней мембраны
    двухмембранной ядерной оболочки (рис.
    74). Мембраны эндоплазматического
    ретикулума (ЭПР) в типичном случае
    составляют более половины от общей
    площади клеточных мембран (таблица 8).
    Хотя мембрана ЭПР имеет многочисленные
    складки и изгибы, она образует одну
    непрерывную поверхность, ограничивающую
    единый замкнутый мешок, внутреннее
    пространство которого занимает более
    10% общего объема клетки (таблица 7). На
    электронных микрофотографиях легко
    различаются две функционально
    различающиеся области ЭПР: гранулярный
    (шероховатый) ЭПР, усеянный рибосомами,
    расположенными на обращенной к цитоплазме
    поверхности мембраны, и гладкий
    (агранулярный) ЭПР (рис. 32). Рибосомы
    удерживаются на мембранах гранулярного
    ЭПР благодаря двум трансмембранным
    гликопротеинам, называемым рибофоринами,
    которые специфически связывают большую
    субъединицу рибосом и которые отсутствуют
    в гладком ЭПР. Количество связанных на
    мембранах рибосом и, следовательно,
    соотношение гладкого и гранулярного
    ЭПР может существенно варьировать в
    клетках (таблица 8). Аппарат Гольджи
    состоит из многочисленных групп плоских
    мембранных мешков (цистерн), собранных
    в структуры, напоминающие стопки тарелок
    и называемые диктиосомами (рис. 75). Одна
    диктиосома в среднем содержит 5 — 10
    цистерн, хотя у низших эукариот их число
    может быть больше 30. Число диктиосом на
    клетку сильно варьирует в зависимости
    от типа клетки — от одной до нескольких
    сотен. В некоторых специализированных
    клетках аппарат Гольджи может даже
    занимать значительную часть объема,
    хотя в типичном случае его доля невелика
    (таблицы 7 и 8). Каждая отдельная цистерна
    диктиосомы имеет переменную толщину:
    в центре ее мембраны сближены так, что
    остается просвет в 25 нм, а на периферии
    имеет расширения (ампулы), ширина которых
    непостоянна. От ампул отшнуровываются
    многочисленные мелкие (диаметром около
    50 нм) и крупные (диаметром около 1 мкм)
    пузырьки (рис. 75). Эти две клетки сильно
    различаются по величине: гепатоцит
    имеет объем около 5000 мкм3, а секреторная
    клетка поджелудочной железы — 1000 мкм3;
    соответственно общин площади их клеточных
    мембран оцениваются как 110 тыс. и 13 тыс.
    мкм2. лизосом колеблется от 0.2 до 0.4 мкм,
    а микротелец — от 0.3 до 1.5 мкм. Число на
    клетку и тех, и других составляет по
    нескольку десятков. Содержимое лизосом
    и микротелец весьма разнородно — от
    гомогенного бесструктурного содержимого
    до плотного гранулярного материала.
    Лизосомы и микротельца различают обычно
    не по морфологическим, а по их биохимическим
    свойствам.

    Растительные
    клетки, в отличие от животных клеток,
    содержат еще одну или несколько вакуолей,
    содержимое которых, называемое клеточным
    соком, отделено от цитозоля одиночной
    мембраной — тонопластом. Как правило,
    вакуоли занимают больше 50% всего объема
    клетки, однако эта величина непостоянна:
    в зависимости от стадии развития и типа
    клетки она может составлять от 5 до 95%.
    Вакуоли в растительной клетке выполняют
    разнообразные функции, из которых
    наиболее важними являются поддержание
    тургорного давления в клетке, запасающая
    и утилизирующая функции. Запасающая и
    утилизирующая функции означают, что в
    вакуолях когут накапливаться как
    запасные вещества (моно- и полисахариды,
    белки), так и отходы клеточного метаболизма
    (например, полифенолы), которые таким
    образом изолируются. В то же время
    концентрирование веществ внутри вакуоли
    и полупроницаемые свойства тонопласта
    способствуют тому, что вакуоль
    функционирует в качестве осмометра, и
    придает растительной клетке необходимую
    прочность и тургисцентность (осмотическую
    напряженность). Ряд веществ, накапливающихся
    в вакуолях, имеет специальные
    функции.

    Например,
    в вакуолях могут накапливаться пигменты,
    придающие яркий цвет растению. Окраска
    лепестков фиалки, герани или примулы
    вызывается пигментами антоцианами,
    накопившимися в клеточном соке вакуолей
    их клеток. Другие вещества вакуолей
    выполняют защитные функции. Некоторые
    растения синтезируют ядовитые или
    горькие вещества (алкалоиды) и накапливают
    их в вакуолях. Алкалоиды высвобождаются
    из ва- куолей при повреждении клеток, и
    таким образом растение может защищаться
    от поедания животными.

    ЭПР,
    аппарат Гольджи, вакуоли, лизосомы и
    микротельца представляют собой единую
    вакуолярную систему, поскольку их
    мембраны, как будет рассказано в следующем
    разделе, постоянно переходят друг в
    друга в процессе функционирования этой
    системы, а компоненты мембран непрерывно
    совершают круговорот в клетке.

    20.
    Рибосома
    — важнейший органоид живой клетки
    сферической или слегка эллипсоидной
    формы, диаметром 100—200 ангстрем, состоящий
    из большой и малой субъединиц. Рибосомы
    служат для биосинтеза белка из аминокислот
    по заданной матрице на основе генетической
    информации, предоставляемой матричной
    РНК, или мРНК. Этот процесс называется
    трансляцией. 

    В
    эукариотических клетках рибосомы
    располагаются на мембранах
    эндоплазматического ретикулума, хотя
    могут быть локализованы и в неприкрепленной
    форме в цитоплазме. Нередко с одной
    молекулой мРНК ассоциировано несколько
    рибосом, такая структура называется
    полирибосомой. Синтез рибосом у эукариот
    происходит в специальной внутриядерной
    структуре — ядрышке. 

    Схема
    синтеза рибосом в клетках эукариот. 

    1.
    Синтез мРНК рибосомных белков РНК
    полимеразой II. 2. Экспорт мРНК из ядра.
    3. Узнавание мРНК рибосомой и 4. синтез
    рибосомных белков. 5. Синтез предшественника
    рРНК (45S — предшественник) РНК полимеразой
    I. 6. Синтез 5S pРНК РНК полимеразой III. 7.
    Сборка большой рибонуклеопротеидной
    частицы, включающей 45S-предшественник,
    импортированные из цитоплазмы рибосомные
    белки, а также специальные ядрышковые
    белки и РНК, принимающие участие в
    созревании рибосомных субчастиц. 8.
    Присоединение 5S рРНК, нарезание
    предшественника и отделение малой
    рибосомной субчастицы. 9. Дозревание
    большой субчастицы, высвобождение
    ядрышковых белков и РНК. 10. Выход
    рибосомных субчастиц из ядра. 11. Вовлечение
    их в трансляцию. 

    Рибосомы
    представляют собой нуклеопротеид, в
    составе которого отношение РНК/белок
    составляет 1:1 у высших животных и
    60-65:35-40 у бактерий. Рибосомная РНК
    составляет около 70 % всей РНК клетки.
    Рибосомы эукариот включают четыре
    молекулы рРНК, из них 18S, 5.8S и 28S рРНК
    синтезируются в ядрышке РНК полимеразой
    I в виде единого предшественника (45S),
    который затем подвергается модификациям
    и нарезанию. 5S рРНК синтезируется РНК
    полимеразой III в другой части генома и
    не нуждаются в дополнительных модификациях.
    Почти вся рРНК находится в виде магниевой
    соли, что необходимо для поддержания
    структуры; при удалении ионов магния
    рибосома подвергается диссоциации на
    субъединицы. 

    Константа
    седиментации (скорость оседания в
    ультрацентрифуге) рибосом эукариотических
    клеток равняется 80S (большая и малая
    субъединицы 60S и 40S, соответственно),
    бактериальных клеток (а так же митохондрий
    и пластид) — 70S (большая и малая субъединицы
    50S и 30S, соответственно).

    Наружная
    мембрана митохондрии имеет толщину
    около 7 нм, не образует впячиваний и
    складок, и замкнута сама на себя. На
    наружную мембрану приходится около 7 %
    от площади поверхности всех мембран
    клеточных органелл. Основная функция —
    отграничение митохондрии от цитоплазмы.
    Наружная мембрана митохондрии состоит
    из билипидного слоя и пронизывающих
    его белков; соотношение липидов и белков
    по массе — примерно 1:1. Особую роль
    играет порин — каналообразующий белок:
    он формирует в наружной мембране
    отверстия диаметром 2-3 нм, через которые
    могут проникать небольшие молекулы и
    ионы весом до 5 кДа.
    Крупные молекулы могут пересекать
    наружную мембрану только посредством
    активного транспорта через транспортные
    белки митохондриальных мембран. Для
    наружной мембраны характерно
    присутствие ферментов:
    монооксигеназы, ацил-СоА-синтетазы и
    фосфолипазы А2.
    Наружная мембрана митохондрии может
    взаимодействовать с мембраной эндоплазматического
    ретикулума;
    это играет важную роль в транспортировке
    липидов и ионов кальция.

    Межмембранное пространство

    Межмембранное
    пространство представляет собой
    пространство между наружной и внутренней
    мембранами митохондрии. Его толщина —
    10-20 нм. Так как наружная мембрана
    митохондрии проницаема для небольших
    молекул и ионов, их концентрацияв
    периплазматическом пространстве мало
    отличается от таковой в цитоплазме.
    Напротив, крупным белкам для транспорта
    из цитоплазмы в периплазматическое
    пространство необходимо иметь
    специфические сигнальные
    пептиды;
    поэтому белковые компоненты
    периплазматического пространства и
    цитоплазмы различны. Одним из белков,
    содержащихся в периплазматическом
    пространстве, является цитохром
    c —
    один из компонентов дыхательной цепи
    митохондрий.

    Внутренняя мембрана

    Внутренняя
    мембрана образует многочисленные
    гребневидные складки — кристы,
    существенно увеличивающие площадь ее
    поверхности и, например, в
    клетках печени составляет
    около трети всех клеточных мембран.
    Характерной чертой состава внутренней
    мембраны митохондрий является присутствие
    в ней кардиолипина —
    особого фосфолипида,
    содержащего сразу четыре жирные
    кислоты и
    делающего мембрану абсолютно непроницаемой
    для протонов.
    Ещё одна особенность внутренней мембраны
    митохондрий — очень высокое
    содержание белков (до
    70 % по весу), представленных транспортными
    белками,ферментами дыхательной
    цепи,
    а также крупными АТФ-синтетазными комплексами.
    Внутренняя мембрана митохондрии в
    отличие от внешней не имеет специальных
    отверстий для транспорта мелких молекул
    и ионов; на ней, на стороне, обращенной
    к матриксу, располагаются особые
    молекулы АТФ-синтазы,
    состоящие из головки, ножки и основания.
    При прохождении через них протонов происходит
    синтез АТФ.
    В основании частиц, заполняя собой всю
    толщу мембраны, располагаются
    компонентыдыхательной
    цепи.
    Наружная и внутренняя мембраны в
    некоторых местах соприкасаются, там
    находится специальный белок-рецептор,
    способствующий транспорту митохондриальных
    белков, закодированных в ядре, в матрикс
    митохондрии.

    Матрикс

    Матрикс —
    ограниченное внутренней мембраной
    пространство. В матриксе (розовом
    веществе) митохондрии находятся
    ферментные системы окисления пирувата жирных
    кислот, а также ферменты цикла трикарбоновых
    кислот (цикла
    Кребса).
    Кроме того, здесь же находится
    митохондриальная ДНК, РНК и
    собственный белоксинтезирующий аппарат
    митохондрии.

    Наружная мембрана бактерий — это эволюционирующий антибиотический барьер

    Наружная мембрана (OM) дидерм «грамотрицательного» класса бактерий является важной органеллой и надежным барьером проницаемости, который не позволяет многим антибиотикам достигать своих внутриклеточных мишеней (1) . OM представляет собой уникальный асимметричный липидный бислой (рис.1): внутренний листок состоит из фосфолипидов (PL), а внешний листок состоит почти исключительно из гликолипида, называемого липополисахаридом (LPS, у бактерий, которые прикрепляют длинные повторы сахара к гликолипиду) или липоолигосахариду (LOS, у бактерий, которые присоединяют только короткий олигосахарид, чтобы покрыть гликолипид) (1).Сборка этих липидов в непрерывный барьер и то, как этот барьер поддерживается в ответ на повреждение, представляет собой увлекательную биологическую проблему. И PL, и LPS / LOS синтезируются внутри клетки, поэтому они должны сначала пройти через внутреннюю мембрану (IM), а затем пройти через враждебную водную периплазматическую среду, прежде чем они будут собраны в OM. Работа последнего десятилетия открыла белковый мостик, который связывает IM и OM и позволяет LPS / LOS течь непосредственно во внешнюю створку OM (2). Как PLs транспортируются в OM, остается загадкой.Понимание путей биогенеза ОМ является актуальной задачей. Срочно необходимы новые антибиотики против грамотрицательных бактерий (3). Уровень устойчивости к антибиотикам продолжает неуклонно расти, в то время как последний действительно новый антибиотик, эффективный против грамотрицательных бактерий, был открыт в 1960-х годах (3). Есть надежда, что лечение, мешающее биогенезу ОМ, предложит новые смертельные терапевтические средства или поможет проникнуть грамотрицательными бактериями в существующие лекарства. Пока это обещание не будет реализовано, клиницисты все чаще вынуждены полагаться на антибиотики в крайнем случае, которые когда-то были исключены из-за их неблагоприятных профилей токсичности, включая нацеленный на ОМ антибиотик колистин (полимиксин E) (4).В PNAS Пауэрс и Трент (5) предоставляют новое понимание того, как устойчивые к колистину бактерии развивают улучшенную физическую форму, изменяя свой состав ОМ. Примечательно, что их работа предоставила неожиданное понимание транспорта PL в клеточной оболочке.

    Рис. 1.

    Архитектура грамотрицательной оболочки. ОМ и ИМ разделены водной периплазмой. ОМ-липиды распределены симметрично, при этом поверхностные гликолипиды (LPS / LOS) удерживаются вместе за счет мостикового соединения двухвалентных катионов. PL находятся во внутренней створке, но могут неправильно локализоваться при повреждении OM.Пути PldA и Mla работают вместе, чтобы удалить неправильно локализованные PL и восстановить асимметрию. В LOS-дефицитных клетках конститутивная активность PldA и Mla вредна, поскольку клетка пытается поддерживать липидный бислой OM.

    Строгая липидная асимметрия в бислое является ключом к барьерной функции OM (Fig. 1). LPS / LOS на поверхности клетки укрепляет мембрану против антибиотиков и детергентов (например, желчных солей) несколькими способами: во-первых, эти молекулы плотно упаковывают внешний листок насыщенными ацильными цепями, которые делают его чрезвычайно гидрофобным, и, во-вторых, липид и сахаридные части отдельных молекул LPS / LOS каждая несут отрицательные заряды, которые позволяют межмолекулярным мостиковым взаимодействиям происходить за счет связывания двухвалентных катионов (1).Эти мостиковые взаимодействия между соседними молекулами LPS / LOS приводят к тесным латеральным взаимодействиям, которые изолируют мембрану от антибиотиков и детергентов, которые в противном случае способны проникать в типичный бислой PL. Полимиксины, класс антибиотиков, который включает колистин, непосредственно повреждают ОМ, нарушая мостиковые взаимодействия LPS / LOS (6). Полимиксины — это катионные молекулы, которые конкурентно связывают отрицательные заряды на LPS / LOS, но, поскольку они не допускают мостиковых взаимодействий, полимиксины ослабляют латеральные взаимодействия LPS / LOS и дестабилизируют ОМ (рис.1) (6).

    Несмотря на то, что колистин редко используется в качестве последнего средства лечения, резистентность к колистину не исчезла. Как правило, любая из нескольких ферментативных модификаций LPS / LOS может уменьшить его отрицательный заряд и тем самым уменьшить связывание колистина (6). Acinetobacter baumannii — распространенный патоген человека с множественной лекарственной устойчивостью, который лечится клинически колистином (6). Пауэрс и Трент (5) исследуют штаммов A. baumannii , которые предприняли замечательный шаг по полной инактивации продукции LOS и стали очень устойчивыми к колистину.Для большинства грамотрицательных бактерий продукция LPS / LOS важна для жизнеспособности; A. baumannii относится к небольшой группе, которая может переносить потерю LOS (7). Эта стратегия резкого сопротивления не обходится без значительных затрат на фитнес. Отсутствие LOS радикально изменяет OM: PL заменяют LOS во внешней створке, и OM становится симметричным бислоем PL. В результате дефицит LOS вызывает серьезное снижение скорости роста in vitro, клетки становятся проницаемыми для больших антибиотиков, а вирулентность заметно снижается (8).

    Последствия недостаточности LOS очевидны, но штаммов A. baumannii остаются жизнеспособными. Что позволяет некоторым бактериям выжить без LPS / LOS, а другим — нет? Потенциально ответ может быть получен при изучении того, как A. baumannii адаптируется к потере LOS. Пауэрс и Трент (5) стремились получить представление о такой адаптации путем последовательного культивирования LOS-дефицитного A. baumannii и изучения спонтанных мутаций, которые возникают для улучшения приспособленности. В течение 120 поколений их данные сходятся к одному центральному выводу: когда ОМ сталкивается с дефицитом липидов (потому что LOS отсутствует), две системы, путь Mla и фосфолипаза PldA ОМ, которые, как предполагается, удаляют PL из ОМ, оказываются вредны для пригодности (рис.1). Спонтанно возникают мутации, инактивирующие как Mla, так и PldA, чтобы повысить скорость роста LOS-дефицитных клеток. Что еще более удивительно, эти мутации также каким-то образом помогают восстановить антибиотический барьер против крупных антибиотиков.

    Химическое повреждение или дефекты сборки ОМ позволяют PLs перемещаться к наружной створке (1). Эти неправильно локализованные PL нарушают липидную асимметрию и нарушают целостность барьера (1). Генетические данные из Escherichia coli показали, что Mla и PldA действуют вместе, чтобы сохранить липидную асимметрию ОМ (9).Мультибелковая система Mla имеет компоненты в каждом отсеке клеточной оболочки: интегральный липопротеин MlaA OM, растворимый периплазматический шаперон MlaC и комплекс транспортера IM ATP-связывающей кассеты (ABC) MlaBDEF (рис. 1) (9⇓⇓⇓ –13). Отсутствие какого-либо белка Mla инактивирует систему и позволяет PL накапливаться во внешнем листке (9). Неправильно локализованные PLs могут быть обнаружены (хотя и косвенно), потому что они становятся субстратами для реакции модификации LPS, которая происходит только во внешней створке OM (14).Эти PL также являются субстратами для PldA фосфолипазы, активный сайт которой стратегически расположен во внешнем листке (15). PldA процессивно деградирует неправильно локализованные PL, чтобы удалить их из OM (Fig. 1) (15). В клетках дикого типа инактивация мутации pldA не вызывает значительных дефектов (9). Однако комбинирование мутаций в pldA и mla вызывает серьезную чувствительность к детергентам и заметное увеличение неправильно локализованных PL; эти дефекты у двойного мутанта больше, чем наблюдаемые с любой одиночной мутацией (9).Более того, спонтанные супрессорные мутации, которые увеличивают продукцию PldA, могут дополнять дефекты мутаций в mla .

    Поскольку их отсутствие приводит к большему количеству PL во внешней створке OM, путям Mla и PldA приписывают роли в удалении PL из OM: PldA путем деградации неправильно локализованных PL и Mla путем транспортировки их обратно в IM. Действительно, IM-белок MlaD принадлежит к классу белков, которые участвуют в импорте липидов в различных организмах. MlaD обладает доменом входа в клетки млекопитающих (MCE), который был идентифицирован в diderm Mycobacterium tuberculosis как важный для вирулентности, но с тех пор было показано, что этот домен связывает липиды (10, 12).В M. tuberculosis белки MCE необходимы для импорта липидов, что позволяет этим бактериям метаболизировать холестерин хозяина (16). Белок MCE присутствует даже в хлоропластах, которые имеют внутреннюю и внешнюю оболочку (вероятно, из-за их цианобактериального происхождения). В растительных клетках липиды обмениваются между эндоплазматическим ретикулумом (ER) и внешней оболочкой мембраны (17). MCE-содержащий белок TGD2 необходим для последующего импорта липидов, происходящих из ER, с внешней на внутреннюю оболочку мембраны, чтобы они могли метаболизироваться в хлоропласт-специфические липиды.

    Предполагаемый ретроградный транспорт PL (от OM к IM) системой Mla был поддержан мутантами mla , проявляющими накопление PL наружных створок, комплементацию этого мутантного фенотипа mla PldA-фосфолипазой и функции Белки MCE (9). Недавние структурные исследования компонента OM, MlaA, выявили центральную пору, открывающуюся к наружной створке, и структуры, которые препятствуют проникновению PL внутренних створок в пору (11, 13).

    Удивительно, но LOS-дефицитный A.Ранее было обнаружено, что baumannii демонстрирует поразительное увеличение транскрипции генов mla (18, 19). Почему клетка должна увеличивать экспрессию системы, которая удаляет липиды из ОМ, если в отсутствие продукции LOS эта органелла сталкивается с дефицитом липидов? Более разумным подходом должно быть увеличение антероградного транспорта PL (от IM к OM) для обеспечения дополнительных PL, которые теперь необходимы для построения OM. Важно отметить, что массовая транспортировка PL в ОВ еще не учтена.Повышение регуляции mla и генов при отсутствии LOS, по-видимому, указывает на то, что, возможно, по крайней мере в этом организме, Mla может функционировать в антероградном направлении или двунаправленно. Замечательная мутация mlaA , по-видимому, частично подтвердила эту возможность. Мутация mlaA *, по-видимому, активно способствует перемещению PL к наружному листку (20). Однако эта деятельность полностью независима от системы Mla; Удаление любого другого гена mla в мутанте mlaA * не подавляет эту активность (20).Скорее, мутантный белок MlaA * функционирует аберрантно, позволяя проходить PL внутренних листочков к внешнему листку (11, 13, 20).

    Обнаружение того, что мутации, инактивирующие как Mla, так и PldA, возникают для увеличения приспособляемости LOS-дефицитного A. baumannii , может указывать только на одно направление транспорта липидов для Mla: он должен работать ретроградным образом. Поскольку LOS-дефицитный OM стал бислоем PL, Mla д. Быть конститутивно активным. Однако его деятельность бесполезна; клетка сталкивается с дефицитом липидов в ОМ.Преимущество пригодности инактивации как Mla, так и PldA позволяет клеткам продолжать накапливать PL в OM в попытке построить OM, который, в конце концов, остается важной органеллой. Выводы Пауэрса и Трента (5) позволяют использовать несколько штаммов и беспристрастный подход: штаммы с дефицитом LOS просто культивируются, и лучшее эволюционное решение побеждает. Итак, поразительно, что одно и то же решение независимо возникло во всех, кроме одного, из эволюционировавших LOS-дефицитных штаммов (задержка несет в себе мутацию в системе передачи сигнала, которая, вероятно, является плейотропной).Эта работа является напоминанием о том, что профили экспрессии генов не обязательно предсказывают ключевые детерминанты приспособленности (21).

    Развитый LOS-дефицитный A. baumannii также демонстрирует повышенную устойчивость к большим антибиотикам, что позволяет предположить, что качество барьера ОМ каким-то образом улучшилось. Учитывая быстрое развитие приспособленности, можем ли мы встретить в клинике устойчивый к колистину, дефицитный по LOS A. baumannii ? Возможно нет. Восстановлена ​​ли вирулентность эволюционирующих штаммов, пока неясно.Даже эволюционировавшие штаммы могут быть легко очищены иммунной системой. Однако стоит отметить, что LOS-дефицитная Neisseria meningitidis была выделена из спинномозговой жидкости в клинике (22). По крайней мере, это богатое и защищенное иммунитетом место может поддерживать рост бактерий с резко измененным ОМ. Штаммы с дефицитом LOS, полученные из клинических источников, не следует сразу сбрасывать со счетов. Результаты Пауэрса и Трента (5) поучительны для оценки как транспорта PL в оболочке грамотрицательных клеток, так и адаптации бактерий к лечению антибиотиками.По мере того, как мы узнаем больше об обоих этих процессах, мы будем лучше подготовлены для разработки стратегий, направленных на борьбу с устойчивостью к антибиотикам.

    Благодарности

    Эта работа была поддержана институциональным финансированием стартапа из Университета Эмори.

    Сноски

    • Автор: K.L.M. и М. написал газету.

    • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

    • См. Сопутствующую статью на стр. E8518.

    Наружная мембрана является важным элементом, несущим нагрузку для грамотрицательных бактерий.

  • 1.

    Згурская, Х. И., Лопес, К. А. и Гнанакаран, С. Барьер проницаемости оболочек грамотрицательных клеток и подходы для его обхода. ACS Infect. Dis . 1 , 512–522 (2015).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 2.

    Мартин, Х. и Франк, Х.Количественный анализ мембран в дерзелванд от Escherichia coli B. Z. Naturforsch. B 17 , 190–196 (1962).

    Артикул

    Google Scholar

  • 3.

    Дэн, Ю., Сан, М. и Шаевиц, Дж. У. Прямое измерение жесткости клеточной стенки при напряжении и тургорного давления в живых бактериальных клетках. Phys. Rev. Lett . 107 , 158101 (2011).

    ADS
    Статья
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 4.

    Höltje, J. V. Рост несущего напряжение и поддерживающего форму murein sacculus Escherichia coli . Microbiol. Мол. Биол. Ред. . 62 , 181–203 (1998).

    PubMed
    PubMed Central

    Google Scholar

  • 5.

    Кох, А. Л. Биофизика бактериальных стенок, рассматриваемых как несущая нагрузку ткань. Microbiol. Ред. . 52 , 337–353 (1988).

    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 6.

    Херрманн, М., Шнек, Э., Гуцманн, Т., Бранденбург, К. и Танака, М. Бактериальные липополисахариды образуют физически сшитые двумерные гели в присутствии двухвалентных катионов. Soft Matter 11 , 6037–6044 (2015).

    ADS
    Статья
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 7.

    Rassam, P. et al. Супрамолекулярные ансамбли лежат в основе обмена белков внешней мембраны у бактерий. Nature 523 , 333–336 (2015).

    ADS
    Статья
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 8.

    Ursell, T. S., Trepagnier, E. H., Huang, K. C. & Theriot, J. A. Анализ экспрессии поверхностных белков выявляет характер роста грамотрицательной внешней мембраны. PLOS Comput. Биол . 8 , e1002680 (2012).

    ADS
    Статья
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 9.

    Cayley, D. S., Guttman, H. J. & Record, M. T., Jr. Биофизическая характеристика изменений количества и активности клеток Escherichia coli и воды в компартментах, а также тургорного давления в ответ на осмотический стресс. Biophys. J . 78 , 1748–1764 (2000).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 10.

    Рохас Э., Териот Дж. А. и Хуанг К. С. Ответ скорости роста Escherichia coli на осмотический шок. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , 7807–7812 (2014).

    ADS
    Статья
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 11.

    de Vries, H. Die Plasmolytische Studien über die Wand Vacuolen (Г. Бернштейн, Берлин, 1885 г.).

    Google Scholar

  • 12.

    Ховатсон А. М. Инженерные таблицы и данные (Springer Science & Business Media, Берлин, 2012).

    Google Scholar

  • 13.

    Tuson, H.H. et al. Измерение жесткости бактериальных клеток по скорости роста в гидрогелях с регулируемой эластичностью. Мол. Микробиол . 84 , 874–891 (2012).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 14.

    Кафлин, Р. Т., Петерсон, А. А., Хауг, А., Паунол, Х. Дж. И МакГроарти, Э.J. Исследование pH-титрования ионных мостиков внутри липополисахаридных агрегатов. Biochim. Биофиз. Acta 821 , 404–412 (1985).

    Артикул
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 15.

    Broady, K. W., Rietschel, E. T. & Lüderitz, O. Химическая структура липидного компонента липополисахаридов из Vibrio cholerae . евро. J. Biochem . 115 , 463–469 (1981).

    Артикул
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 16.

    Лейве Л., Шовлин В. К. и Мергенхаген С. Е. Физические, химические и иммунологические свойства липополисахарида, высвобождаемого из Escherichia coli этилендиаминтетраацетатом. J. Biol. Chem . 243 , 6384–6391 (1968).

    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 17.

    Amro, N.A. et al. Исследование внешней мембраны Escherichia coli с помощью атомно-силовой микроскопии с высоким разрешением: структурная основа проницаемости. Langmuir 16 , 2789–2796 (2000).

    Артикул
    CAS

    Google Scholar

  • 18.

    Руис, Н., Фальконе, Б., Кане, Д. и Силхави, Т. Дж. Химическая обусловленность: генетическая стратегия для исследования сборки органелл. Cell 121 , 307–317 (2005).

    Артикул
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 19.

    Сэмпсон, Б.А., Мисра, Р. и Бенсон, С.А. Идентификация и характеристика нового гена Escherichia coli K-12, участвующего в проницаемости внешней мембраны. Genetics 122 , 491–501 (1989).

    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 20.

    Амир, А., Бабайпур, Ф., Макинтош, Д. Б., Нельсон, Д. Р. и Джун, С. Изгибающие силы пластически деформируют растущие стенки бактериальных клеток. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , 5778–5783 (2014).

    ADS
    Статья
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 21.

    Auer, G. K. et al. Механическая геномика определяет различные модуляторы жесткости бактериальных клеток. Cell Syst . 2 , 402–411 (2016).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 22.

    Billings, G. et al. De novo Морфогенез в L-формах посредством геометрического контроля роста клеток. Мол. Микробиол . 93 , 883–896 (2014).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 23.

    Яо, З., Кане, Д. и Кишони, Р. Отчетливая морфологическая динамика единичных клеток под действием бета-лактамных антибиотиков. Мол. Ячейка 48 , 705–712 (2012).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 24.

    Кавай Ю., Мицкевич К. и Эррингтон Дж. Лизоцим противодействует β-лактамным антибиотикам, способствуя появлению бактерий L-формы. Ячейка 172 , 1038–1049.e10 (2018).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 25.

    Рик П. Д., Хаббард Г. Л. и Барр К. Роль гена rfe в синтезе антигена O8 в Escherichia coli K-12. Дж. Бактериол . 176 , 2877–2884 (1994).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 26.

    Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R. & Stuurman, N. Компьютерное управление микроскопами с помощью μManager. Curr. Protoc. Мол. Биол . 92 , 14.20.1–14.20.17 (2010).

    Google Scholar

  • 27.

    Desmarais, S. M. et al. Высокопроизводительный и высокочувствительный анализ бактериального морфогенеза с использованием ультраэффективной жидкостной хроматографии. J. Biol. Chem . 290 , 31090–31100 (2015).

    Артикул
    PubMed
    PubMed Central
    CAS

    Google Scholar

  • 28.

    Glauner, B., Höltje, J. V. & Schwarz, U. Состав муреина Escherichia coli . J. Biol. Chem . 263 , 10088–10095 (1988).

    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 29.

    Глаунер Б. Разделение и количественное определение муропептидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анал. Биохим . 172 , 451–464 (1988).

    Артикул
    PubMed
    CAS

    Google Scholar

  • 30.

    Hutter, J. L. & Bechhoefer, J. Калибровка наконечников атомно-силовых микроскопов. Rev. Sci. Инструмент . 64 , 1868–1873 (1993).

    ADS
    Статья
    CAS

    Google Scholar

  • Границы | Роль белков внешней мембраны и липополисахаридов в чувствительности Escherichia coli к антимикробным пептидам

    Введение

    Быстрое развитие устойчивости бактерий к классическим антибиотикам происходит во всем мире. Число инфекций, вызываемых бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, увеличивается, и бактериальные инфекции снова становятся угрозой.Подсчитано, что бактериальные инфекции, вызванные бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, приводят к 25000 смертей ежегодно в Европе. В США более 2 миллионов человек заражаются устойчивыми к антибиотикам бактериями в год, и 23 000 человек умирают как прямая причина (Davies et al., 2013; World Health Organization, 2014). В частности, особую озабоченность вызывают инфекции, вызванные грамотрицательными бактериями, устойчивыми почти ко всем доступным в настоящее время лекарствам. Грамотрицательные бактерии с множественной лекарственной устойчивостью представляют большую угрозу для здоровья из-за ограниченных возможностей лечения.Канал разработки новых эффективных противомикробных препаратов, специально нацеленных на грамотрицательные бактерии, остается пустым, несмотря на рост числа бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (Hampton, 2013). В частности, множественная лекарственная устойчивость Enterobacteriaceae, такая как β-лактамаза расширенного спектра (ESBL) и продуцирующая карбапенемаза Escherichia coli , вызывают серьезную озабоченность, поскольку обладают устойчивостью к доступным в настоящее время антибиотикам (Kanj and Kanafani, 2011; Antibiotics Current in Clinical Development, 2014).

    В отличие от грамположительных бактерий, все грамотрицательные бактерии окружены дополнительной мембраной, так называемой внешней мембраной (ОМ) (рис. 1). В отличие от цитоплазматической мембраны, OM сильно асимметричен, с внутренним листком, содержащим фосфолипиды, и внешним листком, в основном состоящим из липополисахаридов (LPS). ЛПС грамотрицательных бактерий, включая E. coli , состоит из трех частей (Рисунок 1): (i) липид A, гидрофобный мембранный якорь, образующий внешний листок OM, (ii) фосфорилированное неповторяющееся ядро олигосахарид (core-OS) и, следовательно, имеет высокоанионную природу, и (iii) O-антиген (O-полисахарид), состоящий из цепочки нескольких типов повторяющихся сахарных единиц, действующих как поверхность гидрофильного покрытия (Erridge et al., 2002; Raetz and Whitfield, 2002). Липид А является высококонсервативным среди грамотрицательных бактерий, в отличие от О-антигена, который очень гибок. Ядро-OS E.coli разделено на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D-, манно -октулозоновой кислоты (Kdo) и одного или нескольких L- глицеро -D- . manno — остатки гептозы и внешняя область, состоящая из различных связанных сахарных остатков. Основные характеристики внутренней области core-OS сохраняются у представителей Enterobacteriaceae , что предположительно отражает его критическую роль в стабильности OM (Caroff and Karibian, 2003).В E. coli внутренняя область ядра core-OS может быть дополнительно модифицирована с помощью различных нестехиометрических замен в зависимости от типа core-OS (Heinrichs et al., 1998b). Внешняя область core-OS демонстрирует большую изменчивость, что определяет пять различных типов ядра в E. coli (K12, R1, R2, R3 и R4) (рис. 2). Все типы ядер имеют общую структурную тему с (гексозой) 3 углеводной основной цепью и двумя остатками боковой цепи. Однако порядок остатков гексозы, а также положение, природа и связь боковой цепи варьируются от каждого типа ядра (рис. 2).Большинство клинических изолятов E. coli имеют гладкий LPS (S-LPS), который состоит из всех трех частей, включая O-антиген, тогда как E. coli с грубым LPS (R-LPS) не содержит O-антигена и может даже иметь усеченное ядро ​​ОС (глубокая грубость). Минимальный LPS, необходимый для роста, состоит из липида A и Kdo (3-дезокси-D-, манно -окт-2-улозоновая кислота) (Frirdich and Whitfield, 2005).

    Рисунок 1 . Общая структура клеточной оболочки Escherichia coli K-12.Схематическое изображение клеточной оболочки E. coli K-12.

    Рисунок 2 . Структура core-OS Escherichia coli . (A) Структура внутренней области core-OS типов ядра E. coli . Пунктирными линиями обозначены нестехиометрические замены, и указаны отличительные модификации различных типов ядер. (B) Структура внешней области сердечника-ОС типов сердечника R1, R2, R3, R4 и K-12.Glc, глюкоза; GlcN, глюкозамин; Hep, L- глицеро -D- manno -гептопираноза; Кдо, 3-дезокси-D- манно- окт-2-улозоновая кислота; Ра, раммонс; Гал, галактоза; GlcNAc, N- ацетилглюкозамин; ПЭТН, фосфорилэтаноламин.

    ОМ необходим для жизнеспособности клеток и служит барьером проницаемости, предотвращающим проникновение вредных токсичных соединений (Savage, 2001; Raetz and Whitfield, 2002; Nikaido, 2003). Общий состав и структура ОВ широко сохранены с небольшими вариациями у разных видов (Vaara, 1992).LPS, являясь основным компонентом внешней створки OM, играет центральную роль в целостности и избирательной проницаемости OM. Заряженные макромолекулы не могут проникнуть в ОВ, в то время как многим гидрофобным молекулам разрешена ограниченная диффузия (Nikaido, 2003). LPS, в частности core-OS, играет важную роль в обеспечении селективности по отношению к гидрофобным молекулам. Благодаря анионным фосфатным группам во внутренней области ядра OS, молекулы LPS способны образовывать межмолекулярные электростатические связи с соседними молекулами LPS через двухвалентные катионы, в основном Mg 2+ и Ca 2+ (Vaara, 1992). .Это перекрестное связывание соседних молекул ЛПС в значительной степени способствует устойчивости к гидрофобным антимикробным агентам. Анионная природа липида A и внутренней области core-OS, по-видимому, является ахиллесовой пятой для целостности OM (Schneck et al., 2010).

    Однако ОМ E. coli состоит не только из ЛПС, но и из других компонентов, таких как белки внешней мембраны и липопротеины (рис. 1). Lpp или муреин-липопротеин — самый распространенный липопротеин E.coli , и, по оценкам, это самый распространенный белок, содержащий более 500 000 молекул на клетку (Vaara, 1992; Neidhardt and Umbarger, 1996). Lpp состоит из 58 амино и существует в двух формах: (i) «связанная форма», в которой Lpp ковалентно связан со слоем пептидогликана через ε-аминогруппу С-концевого лизина (Nikaido, 1996) и (ii ) «свободная форма» (Браун и Рен, 1969; Браун и Вольф, 1970; Браун и Бош, 1972). Функция «свободный от» не изучена, однако было показано, что «свободный от» обнажается на поверхности своим С-концом (Cowles et al., 2011). «Связанная форма» Lpp является важным структурным компонентом в поддержании стабильности и целостности ОМ. Клетки, лишенные Lpp, обнаруживают несколько дефектов ОМ, таких как повышенная проницаемость ОМ для малых, токсичных молекул и антибиотиков и утечка периплазматического содержимого (Hirota et al., 1977; Suzuki et al., 1978).

    Противомикробные пептиды (АМП) вновь привлекают внимание как потенциальная альтернатива классическим антибиотикам, борющимся с бактериальными инфекциями, включая инфекции, вызываемые грамотрицательными патогенами.Катионные противомикробные пептиды представляют собой самый большой класс AMP и присутствуют практически во всех группах организмов, таких как бактерии, грибы, растения и животные. Катионные АМП характеризуются положительным зарядом и гидрофобной областью, но их размеры, последовательности и вторичные структуры широко варьируются. Широко распространено мнение, что положительный заряд катионных АМП обеспечивает электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными микробными мембранами (Yeaman and Yount, 2003; Jenssen et al., 2006) и что гидрофобная область участвует в проникновении в клетки (Aoki и Уэда, 2013).

    Целью нашей работы является исследование антимикробной активности выбранных катионных AMP против грамотрицательных бактерий, в частности E. coli . В частности, мы изучили потенциальную роль внешней мембраны, которая выполняет решающую роль в обеспечении дополнительного слоя защиты, действующего как селективный барьер. Более конкретно, мы проанализировали потенциальную роль определенных компонентов ОМ, таких как LPS, Lpp и OmpT, протеаза внешней мембраны, в антимикробной активности катионных AMP.Мы измерили минимальную ингибирующую концентрацию катионных АМП Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 , мелиттина, индолицидина, цекропина P1 и цекропина B против E. coli BW25113 (K12) и изогенных мутантов, дефектных по LPS. компоненты, Lpp или OmpT. Кроме того, мы проанализировали чувствительность E. coli F470, E. coli F632, E. coli F653 и E. coli F2513, представляющих прототипы R1, R2, R3 или R4, против выбранные катионные AMP.Наконец, мы исследовали механизм действия Cap18 путем анализа антимикробной активности выбранных производных Cap18 против E. coli ATCC25922 дикого типа, а также мутантов LPS.

    Материалы и методы

    Бактериальные штаммы и условия роста

    Все штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Штаммы E. coli 470, F632, F653 и F2513 были любезно предоставлены профессором Х. Брэйдом и профессором С. Мюллер-Лоеннис, Исследовательский центр Борстел, Лейпниц. -Центр медицины и биологических наук, Германия. E. coli BW25113 (CGSC #: 7636), производное F , λ E. coli Штамм K12 BD792 — штамм дикого типа, который использовался при создании коллекции KEIO и заказано в Центре генетических запасов кишечной палочки (CGSC, Йельский университет). E. coli JW3596, E. coli JW3024, E. coli JW3595, E. coli JW3606, E. coli JW0212, E. coli JW1667, E. coli JW0554, Э.coli JW3605 и E. coli JW3600 являются изогенными мутантами waaC, waaE, waaF, waaG, gmhA (lpcA), lpp, ompT, waaP или waaY , полученными из родительского штамма E. coli и были заказаны из коллекции KEIO (Баба и др., 2006). E. coli ATCC25922 — клинический изолят серотипа O6, часто используемый в качестве контрольного штамма в тестах на чувствительность к противомикробным препаратам, заказывался из коллекции штаммов ATCC. Все штаммы выращивали в среде Мюллера-Хинтона-II, инкубацию проводили в аэробных условиях при 37 ° C в течение 18–20 часов.

    Таблица 1 . Бактериальные штаммы, использованные в этом исследовании.

    Противомикробные пептиды

    Аминокислотная последовательность, происхождение и структура цекропина P1, цекропина B, Cap18, Cap11, Cap11-1-12m 2 , мелиттина и индолицидина обобщены в таблице 2. Цекропин B, цекропин P1 и сульфат колистина (C4461) были приобретены у Sigma-Aldrich. Цекропин B с чистотой ≥97% и цекропин P1 с чистотой ≥95% растворяли в воде. Сульфат колистина растворяли в воде.Cap11 (чистота 94,7%), Cap11-1-18m 2 (чистота 87,9%) и Cap18 (чистота 89,5%) были синтезированы в Genscript. Cap18 и Cap11 растворяли в ДМСО, Cap11-1-18m 2 растворяли в воде. Мелиттин (RP10290) и индолицидин (RP11242-0,5), каждый с чистотой> 95%, были приобретены у Genscript и растворены в воде. Производные Cap18, использованные в этом исследовании, были приобретены в виде химически синтезированных пептидов высокой чистоты у Genscript или Peptide 2.0. Аминокислотная последовательность и чистота каждого производного Cap18 сведены в Таблицу 6.Все пептиды растворяли до исходной концентрации 10 мг / мл, за исключением сульфата колистина, который растворяли до исходной концентрации 50 мг / мл и хранили при -20 ° C.

    Таблица 2 . Катионные противомикробные пептиды, использованные в этом исследовании: последовательность, происхождение и структура.

    Тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (определение MIC)

    Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) AMP измеряли в 96-луночных микротитровальных планшетах в соответствии с Институтом клинических и лабораторных стандартов [CLSI, ранее Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS)] (Wikler et al., 2009). Жидкую среду Мюллера-Хинтона-II, содержащую возрастающие концентрации AMP, инокулируют определенным количеством клеток (~ 10 5 КОЕ / мл) в 96-луночных микротитровальных планшетах (полипропилен). Каждый микротитровальный планшет включает положительный контроль роста и отрицательный контроль (стерильный контроль). После инкубации определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) по самой низкой концентрации, при которой не наблюдается видимого роста. Все чашки инкубировали 16–20 ч.

    Результаты

    OmpT не влияет или оказывает незначительное влияние на антимикробную активность катионных AMP в Escherichia coli

    K12 BW25113

    OmpT, член аспартилпротеаз, обнаружен во внешнем члене E.coli и отвечает за расщепление пептидов и белков между двумя последовательными основными аминокислотными остатками (Sugimura and Nishihara, 1988; Kramer et al., 2000, 2001). Ранее было показано, что мутант E. coli Δ ompT является сверхчувствительным к протамину AMP (Stumpe et al., 1998), и что OmpT энтерогеморрагической E. coli (EHEC) расщепляет LL-37, человеческий гомолог Cap18 (Thomassin et al., 2012). Чтобы оценить роль OmpT в K12 E.coli BW25133, мы исследовали антимикробную активность семи катионных AMP из разных классов и происхождения, а также антибиотика колистина против мутанта ompT , который был выбран из коллекции KEIO (Baba et al., 2006). Антимикробная активность была измерена как минимальная ингибирующая концентрация (MIC) и суммирована в таблице 3. На активность кателицидина Cap18, гомолога LL-37, не влияет мутант ompT по сравнению с родительским штаммом BW25113 (таблица 3) .Cap11, другой член семейства кателицидинов, немного более активен, вплоть до фактора 2, в мутантном штамме ompT по сравнению со штаммом дикого типа. Однако MIC Cap11-1-18m 2 , более короткое производное Cap11, не изменяется на фоне ompT . Подобно Cap11, антимикробная активность цекропина B и цекропина P1 увеличивается до фактора 2. В отличие от этого, антимикробная активность индолицидина не затрагивается, а мелиттин немного менее эффективен (до фактора 2) у мутанта ompT . задний план.Противомикробная активность полипептидного антибиотика колистина не изменилась у мутанта ompT . Растворитель ДМСО не обладал антимикробной активностью в концентрациях, используемых в анализах MIC (данные не показаны). Основываясь на этих результатах, мы можем предположить, что протеаза внешней мембраны OmpT не оказывает или оказывает незначительное влияние на антимикробную активность катионных AMP.

    Таблица 3 . Чувствительность мутантов E. coli BW25113, дефицитных по внешней мембране, к катионным антимикробным пептидам.

    Тестирование чувствительности

    E. coli BW25113 lpp :: kan к катионным антимикробным пептидам

    Хотя известно, что делеция гена lpp приводит к повышенной лекарственной чувствительности, антимикробная активность катионных AMP не анализировалась более детально с использованием изогенных штаммов. Чтобы исследовать потенциальную роль Lpp в антимикробной активности катионных AMP, мутант BW25133 lpp :: kan был выбран из коллекции KEIO и протестирован на чувствительность к антимикробным препаратам.Из-за ограниченного количества доступного пептида только Cap18, Cap11, Cap11-1-12m 2 , цекропин B и колистин были протестированы на антимикробную активность у мутанта lpp (таблица 3). Значения MIC для цекропина B, Cap11 и Cap11-1-12m 2 не изменились в мутантном штамме lpp по сравнению с штаммом дикого типа. Только для Cap18 и колистина можно было обнаружить минимальное увеличение фактора 2 чувствительности к противомикробным препаратам. Основываясь на наших результатах, мы можем сделать вывод, что Lpp не играет центральной роли в антимикробной активности большинства протестированных катионных AMP.Только для Cap18 и колистина Lpp играет второстепенную роль в антимикробной активности.

    Повышение антимикробной чувствительности к катионным антимикробным пептидам при дефиците ЛПС

    E. coli Мутанты

    Чтобы понять влияние LPS, в частности core-OS, на антимикробную активность катионных AMP, несколько мутантов LPS были отобраны из коллекции KEIO и проанализированы на чувствительность к антимикробным препаратам. Были выбраны три различных набора мутантов LPS, один набор мутантов, несущих делеции генов, участвующих в сборке молекулы LPS, включая гликозил- и гептозилтрансферазы ( waaC, waaF и waaG ), один набор содержит ферменты, модифицирующие LPS, такие как как киназы LPS waaP и waaY , и третий набор, состоящий из мутантов, дефицитных по синтезу ADP-гептозы ( gmhA и waaE) , который является предшественником молекулы LPS гептозы.МИК Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 , мелиттина, индолицидина, церопина P1, цекропина B и колистина измеряли для штаммов E. coli BW25113, несущих мутацию в waaG, waaC, waaE, waaF или gmhA , все гены, необходимые для ядра ОС ЛПС, и штамм дикого типа BW25113. Значения MIC приведены в таблице 3. За исключением Cap11, все испытанные катионные AMP показали более высокую антимикробную активность против мутантов waaC, waaF, waaG, waaE и gmhA по сравнению с родительским штаммом BW25113.Наибольшее увеличение (от 8 до 16 раз) антимикробной активности было зарегистрировано для мелиттина против BW25113 gmhA :: kan . Кроме того, восприимчивость BW25113 waaC :: kan , BW25113 waaF :: kan , BW25113 waaG :: kan и BW25113 waaE :: kan была увеличена в 4-8 раз по сравнению с диким -тип штамма. Цекропин P1 и цекропин B более активны в фонах мутантов LPS; В 4–8 раз активнее на фоне waaF :: kan , в 4 раза активнее на фоне gmhA :: kan , в 2–4 раза активнее на фоне waaC :: kan и waaE :: kan и до В 2 раза более активен на фоне waaG :: kan по сравнению с родительским штаммом BW25113.Индолицидин вдвое активнее, а Cap11-1-18m 2 показывает небольшое, до 2-кратного увеличения антимикробной активности у всех протестированных мутантов LPS по сравнению со штаммом дикого типа. Точно так же делеции waaC, waaE, waaF и waaG показывают немного повышенную чувствительность (до 2 раз) к Cap18. Для сравнения, полипептидный антибиотик колизитин проявлял немного повышенную антимикробную активность (до фактора 2) против мутантов waaC, waaF, waaG, waaE и gmhA .Помимо ферментов, непосредственно участвующих в синтезе основного олигосахарида, мы проанализировали влияние ферментов, модифицирующих ЛПС, таких как киназа ЛПС waaP и waaY , ответственных за фосфорилирование гептозы I и гептозы II. WaaP фосфорилирует остаток гептозы I, тогда как waaY отвечает за фосфорилирование остатка гептозы II. Однако у мутанта waaP оба сахарных остатка, гептоза I и гептоза II, остаются нефосфорилированными (Yethon et al., 1998). Чувствительность к противомикробным препаратам мутанта waaP не изменяется для Cap18, Cap11, цекропина B, цекропина P1, индолицидина и колистина. Только мелиттин в 4-8 раз более активен на фоне мутанта waaP по сравнению со штаммом дикого типа. Инактивация waaY не влияла на активность Cap18, Cap11, цекропина P1, мелиттина и индолицидина, тогда как цекропин B был немного менее активен (до фактора 2). Основываясь на наших результатах, мы можем сделать вывод, что LPS, в частности сахарная структура core-OS, играет важную роль в антимикробной активности катионных AMP.Однако усиление антимикробной активности тестируемых AMP против отдельных мутантов LPS сильно зависит от природы самого AMP. Антимикробная активность Cap18, Cap11 и Cap11-1-18m 2 , всех членов семейства кателицидинов, не затрагивается или затрагивается лишь незначительно во всех протестированных мутантах LPS по сравнению с мутантами дикого типа, тогда как мелиттин в 4 раза активнее в любой из протестированных мутантов LPS с усечением сахарного остова. Напротив, эффект фосфорилирования сахарного остатка гептозы I и гептозы II незначителен.Антимикробная активность большинства протестированных AMP, а также полипептидного антибиотика колистина не изменилась в waaP и waaY . Только мелиттин в 4 раза активнее в мутанте waaP , но не в мутанте waaY .

    Основной тип

    Escherichia coli определяет антимикробную активность катионных AMP

    Чтобы изучить роль LPS более подробно, мы проанализировали потенциальную роль различных сахарных фрагментов во внешней части core-OS в E.coli . Таким образом, мы определили антимикробную активность выбранных катионных AMP против пяти штаммов E. coli , представляющих пять различных типов ядра (R1, R2, R3, R4 и K12). Отобранные AMP были протестированы на антимикробную активность против E. coli ATCC25922, E. coli BW25113 (K12), E. coli F470 (прототип R1, грубый LPS), E. coli F632 (прототип R2 , грубый LPS), E. coli, F653 (прототип R3, грубый LPS) и E.coli F2513 (прототип R4, грубый LPS). Антимикробная активность была измерена как минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и суммирована в таблице 4. Антимикробная активность Cap18 очень похожа на все протестированные штаммы E. coli со значениями МИК 4-8 мкг / мл. Только E. coli F2513 немного более восприимчивы к Cap18 со значением MIC 2–4 мкг / мл. Антимикробная активность Cap11, другого члена семейства кателицидинов, варьируется в 2–4 раза в зависимости от типа ядра.Cap11 проявляет наивысшую антимикробную активность против E. coli F2513, прототипа R4. Точно так же Cap11-18m 2 , короткое производное Cap11, наиболее эффективно против E. coli F2513. В отличие от AMP из семейства кателицидинов, мелиттин демонстрирует самые большие различия в антимикробной активности в зависимости от типа ядра. Антимикробная активность мелиттина, например, в 4-8 раз выше против E. coli F2513 (тип ядра R4), чем против BW25113 (K12). Значение МИК индолицидина против E.coli F2513 в 4–2 раза ниже значений МИК, измеренных для других штаммов. Значения MIC, измеренные для цекропина P1, очень похожи для всех измеренных штаммов, что указывает на то, что активность цекропина P1 не зависит от типа ядра. Аналогично для цекропина B было измерено небольшое изменение МИК (≤2-кратное) в зависимости от типа ядра. Таким образом, антимикробная эффективность тестируемых катионных AMP варьируется в зависимости от типа ядра E. coli . Все протестированные катионные пептиды наиболее активны против E.coli F2513, который представляет тип ядра R4. Это открытие указывает на то, что сахарные фрагменты внешней области ядра core-OS могут играть важную роль в антимикробной активности катионных AMP. Однако отдельные AMP различаются по степени селективности LPS. Мелиттин показал наибольшую разницу в значениях MIC в диапазоне от 4 до 32 мкг / мл в зависимости от изолята и типа ядра. Напротив, значения MIC для Cap18 показывают лишь минимальные вариации (до фактора 2) в зависимости от штамма.Это говорит о том, что Cap18 нацелен на E. coli эффективным способом независимо от типа ядра.

    Таблица 4 . Антимикробная активность выбранных антимикробных пептидов в Escherichia coli с различными типами ядра LPS.

    Антимикробная активность образца

    E. coli ATCC25922 аналогична Core типа R1

    Одним из наиболее часто используемых штаммов E. coli в тестах на чувствительность к противомикробным препаратам является E.coli ATCC25922. E. coli ATCC25922 — это клинический изолят с гладким LPS (серотип 6), который служит эталонным штаммом при тестировании чувствительности к противомикробным препаратам и использовался в предыдущем исследовании, посвященном антимикробной активности Cap18. Тип ядра ATCC25922 до сих пор не идентифицирован. Мы измерили антимикробную активность выбранных катионных AMP против E. coli, ATCC25922 и сравнили значение MIC с BW25311, F470, F632, F653 и F2513, все они содержат грубый LPS и представляют различные основные типы (Таблица 4).Антимикробная чувствительность ATCC25922 ко всем протестированным AMP очень похожа на F470. Это указывает на то, что ATCC25922 может быть членом типа ядра R1.

    Восстановление антимикробной активности производных CAP18 путем изменения структуры внутренней области ядра LPS

    В предыдущем исследовании мы проанализировали антимикробную активность Cap18 и смогли создать производные Cap18 с улучшенным видо-селективным уничтожением (Ebbensgaard et al., 2018).Наряду с нашими текущими результатами, демонстрирующими, что антимикробная активность Cap18 не зависит или только незначительно зависит от присутствия внутренней области ядра или сахарного состава внешней области ядра OS, мы решили исследовать механизм Cap18 и подробнее о роли LPS. Для этого анализа мы выбрали набор производных Cap18 с видоспецифичными убивающими свойствами. Основываясь на нашем предыдущем исследовании, мы выбрали 12 производных Cap18, которые утратили свою антимикробную активность против E.coli ATCC25922 (МИК ≥ 64 мкг / мл). Каждое из этих 12 производных содержит одну единственную аминокислотную замену по сравнению с исходным пептидом Cap18. Кроме того, мы отобрали 8 производных, проявляющих такую ​​же антимикробную активность, что и исходный пептид Cap18 (MIC = 4-8 мкг / мл), и были включены в исследование в качестве контрольных пептидов. Аминокислотные последовательности и чистота выбранных производных Cap18 суммированы в таблице 5. Для всех 20 производных Cap18 антимикробную активность исследовали, измеряя значение MIC против E.coli ATCC29522 Δ waaC, E. coli ATCC29522 Δ waaE, E. coli ATCC29522 Δ waaF, E. coli ATCC29522Δ waaG и родительский штамм ATCC29522 (таблица 6).

    Таблица 5 . Производные Cap18: аминокислотная последовательность, чистота, растворитель, производитель.

    Таблица 6 . Антимикробная активность производных Cap18 в отношении мутантов ЛПС E. coli, ATCC25922 и других энтеробактерий.

    Противомикробная активность может быть полностью восстановлена ​​для четырех производных путем удаления любого из wwaC, waaE, waaF или waaG в фоне ATCC29522.Более подробно, Cap18, несущий замену L17K, I20E, I24G или L27P, не проявляет антимикробной активности против E. coli ATCC29522, но восстанавливает полную антимикробную активность (значение MIC: 4-8 мкг / мл) у мутантов LPS, несущих делецию. либо в wwaC, waaE, waaF или waaG . Производное Cap18 с заменой I24N восстановило полную антимикробную активность на фоне мутанта waaC и waaF по сравнению с ATCC29522 дикого типа. Однако делеция waaE и waaG привела только к частичному восстановлению антимикробной активности I24N.Точно так же замена I20N может успешно восстановить антимикробную активность Cap18 на фоне мутанта waaF и частично восстановить активность в Δ waaC , Δ waaE и Δ waaF . Cap18 I13R не был активен как в диком типе, так и в мутанте waaE (MIC ≥ 64 мкг / мл), однако полностью активен в мутанте waaG и частично активен в waaF и waaC мутанты. Антимикробная активность производных Cap18, содержащих замену I13P или I24D, оба неактивные в ATCC29522, могла быть восстановлена ​​только частично путем удаления wwaC, waaE, waaF или waaG .Интересно, что Cap18 I13D, L17D и L17P были неактивны против всех тестируемых штаммов, включая мутанты LPS. Производные Cap18, проявляющие антимикробную активность, сравнимую с исходным пептидом Cap18 (MIC = 4-8 мкг / мл), показали либо неизменную, либо слегка улучшенную (фактор 2) антимикробную активность у мутантов LPS по сравнению с исходным пептидом Cap18 (таблица 6). Подводя итог, мы смогли продемонстрировать, что изменение структуры LPS E. coli ATCC25922, в частности внутренней области core-OS, может привести к восстановлению антимикробной активности отдельных производных Cap18, которые не были активны в родительском ATCC25922. штамм.

    Обсуждение

    Бактериальные патогены выработали различные механизмы противодействия антимикробной активности катионных AMP (Peschel and Sahl, 2006). Производство протеаз, разрушающих и тем самым инактивирующих катионные AMP, является одним из очевидных способов защиты бактерий от антимикробных препаратов. Некоторые омптины, такие как OmpT и PgtE, все протеазы, обнаруженные в OM различных грамотрицательных патогенов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae , были связаны с деградацией AMP (Hritonenko and Stathopoulos, 2007).В частности, OmpT участвует в протеолитической деградации протамина и LL-37, человеческого гомолога Cap18. При измерении значений MIC для Cap18, мелиттина и индолицидина не было обнаружено никаких изменений на фоне мутанта ompT по сравнению с исходным E. coli BW25113. Аналогичным образом, только незначительное увеличение антимикробной активности Cap11, Cap11-1-18m 2 , цекропина P1 и цекропина B было обнаружено в мутантном штамме ompT по сравнению с штаммом дикого типа.Наши данные ясно показывают, что OmpT играет лишь второстепенную роль в защите E. coli K-12 от катионных AMP. Это согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что MIC LL-37, человеческого гомолога Cap18, не изменилась в CFT073Δ ompT по сравнению с CFT073 дикого типа, уропатогенным штаммом E. coli (Brannon et al. , 2013). Аналогичные результаты наблюдались для EPEC E2348 / 69, энтеропатогенного E. coli . Значение MIC LL-37 не изменилось в мутанте Δ ompT по сравнению с исходным штаммом.Для C18G, другого AMP, небольшое снижение MIC (фактор 2) наблюдалось у мутанта Δ ompT (Thomassin et al., 2012). Несмотря на отсутствие или незначительное влияние OmpT на восприимчивость, было продемонстрировано, что OmpT из E. coli CFT073 и E. coli EPEC E2348 / 69 опосредуют деградацию LL-37 (Thomassin et al. , 2012; Браннон и др., 2013). Влияние OmpT на восприимчивость было более выражено у энтерогеморрагической E. coli EHEC EDL933.Значения MIC для LL-37 были уменьшены в 2 раза, а для C18G — в 8 раз. В целом это указывает на то, что вклад OmpT в деградацию и инактивацию AMP в целом незначителен, однако также зависит от самого AMP и природа штамма E. coli .

    Природа клеточной поверхности, в частности состав ОМ грамотрицательных бактерий, оказывает большое влияние на антимикробную активность и эффективность антимикробных агентов, включая катионные AMP.Поэтому мы исследовали роль Lpp, который является наиболее распространенным белком в E. coli , присутствующим либо в виде Lpp, экспонированного на свободной поверхности, либо в связанной форме, соединяющей пептидогликан с OM. Недавно было продемонстрировано, что Lpp специфически связывается с α-спиральными AMP, такими как Cap18, LL-37 и SMAP-29, но не с полимиксином B. Была предложена модель, в которой Lpp действует как рецептор для Cap18, LL- 37 и SMAP-29, непосредственно влияющие на чувствительность α-спиральных катионных АМП (Chang et al., 2012). Однако наши данные демонстрируют, что удаление гена lpp приводит к немного повышенной чувствительности, что указывает на то, что Cap18 эффективно убивает E. coli BW25113 даже в отсутствие Lpp. Основываясь на наших выводах, мы заключаем, что присутствие Lpp не требуется для антимикробной активности тестируемых катионных AMP, таких как Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 и церкопин B против E. coli BW25133. Истощение клетки для обеих форм Lpp, «свободной от», которая подвергается воздействию поверхности, а также «связанной формы» с четко определенной периплазматической функцией путем удаления гена lpp может привести к измененному ОМ.Было показано, что мутанты с дефицитом общего Lpp продуцируют везикулы OM и выделяют периплазматические белки (Hirota et al., 1977). Совсем недавно структура чувствительности к различным антибиотикам была исследована на L51, производном E. coli K-12, и на изогенном мутанте Δ lpp . Подобно нашим результатам для катионных AMP, чувствительность к ванкомицину, эритромицину и рифампицину была немного увеличена в мутанте Δ lpp по сравнению с родительским штаммом (Kowata et al., 2016). Несмотря на то, что было продемонстрировано, что Lpp способен связывать α-спиральные катионные AMP, Lpp, по-видимому, играет лишь незначительную роль в антимикробной чувствительности E. coli к катионным AMP, которые мы тестировали в нашем исследовании.

    Хорошо известно, что ЛПС играет центральную роль в проницаемости мембран и, следовательно, оказывает большое влияние на антимикробную активность, главным образом, гидрофобных антибиотиков (Vaara, 1993; Delcour, 2009). Одним из основных интересов этого исследования было выяснение роли ЛПС в антимикробной активности катионных АМП, уделяя особое внимание как влиянию структуры внутренней и внешней области ядра-ОС, так и фосфорилированию ядра. -ОПЕРАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ.Исходя из наших результатов, мы можем сделать вывод, что изменения структуры внутренней области core-OS оказывают большое влияние на антимикробную активность катионных AMP, и большинство протестированных AMP проявляют повышенную антимикробную активность у мутантов deep raw E ..coli В E. coli область внутреннего ядра OS может иметь защитную функцию, предотвращая связывание катионных AMP с внутренним ядром OS, которое рассматривается как ахиллесова пята LPS. Связывание катионных AMP с внутренним ядром OS может вызвать усиленную латеральную диффузию LPS.Это вызвано смещением двухвалентных катионов, обычно стабилизирующих соседние молекулы LPS за счет электростатических взаимодействий и приводящих к увеличению проницаемости ОВ. Удалив внешнюю область core-OS, AMP получат более легкий доступ к клеточной мембране, что способствует проникновению AMP за счет самодостаточного поглощения. Это согласуется с предыдущими исследованиями, которые продемонстрировали, что внешняя область сердцевины ОС играет защитную роль против крупных катионных антимикробных агентов, таких как колицин N, и что внешняя область сердцевины ОС ослабляет неспецифические взаимодействия между колицином N и поверхность мембраны (Clifton et al., 2016). Однако степень повышенной восприимчивости сильно зависит от природы самого AMP. Чувствительность тестируемых мутантов, дефицитных по внутреннему коровому региону OS, например, не изменилась для Cap11 по сравнению со штаммом дикого типа, тогда как те же мутанты в 4-8 раз более восприимчивы к мелиттину по сравнению с родительским штаммом. Не только природа AMP, но и удаленный ген, по-видимому, играет решающую роль в антимикробной активности некоторых AMP. Например, мутант waaF проявляет в 4-8 раз повышенную восприимчивость к цекропину P1 и цекропину B по сравнению с мутантом waaG только в 2 раза более восприимчивым.Фосфорилирование остатков сахара HepI и HepII играет второстепенную роль в антимикробной активности большинства тестируемых AMP, за исключением мелиттина. Только мелиттин на 4-8 более активен в E. coli , в котором отсутствуют все фосфатные группы во внутренней области ядра. Однако ранее было продемонстрировано, что мутант waaY , у которого отсутствует фосфатная группа на HepII, менее восприимчив к LL-37, но не к другим AMP, включая CRAMP, SMAP-29, BMAP-27, Bac7 или полимиксин (Bociek et al., 2015). Эти результаты позволяют предположить, что E. coli с внутренней областью ядра OS, не содержащей фосфатов, может быть более или менее восприимчивым к катионным AMP, что предполагает более специфические взаимодействия отдельных AMP и LPS.

    Кроме того, наши находки предполагают, что не только внутренняя область ядра core-OS, но также и внешняя область core-OS важна для способа действия катионных AMPs в E. coli . Состав различных сахарных фрагментов внешней области ядра-OS определяет антимикробную активность некоторых из протестированных катионных AMP, включая Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 , мелиттин и индолицидин. E. coli F2513, представляющий тип ядра R4, в 4-8 раз более чувствителен к мелиттину, чем штаммы E. coli , представляющие тип ядра K-12, R1, R2 или R3. Точно так же индолицидин, Cap18, Cap11 и Cap11-1-18m 2 в 2 раза более эффективны в отношении E. coli F2513. Напротив, для цекропина B, как и для цекропина P1, состав внешней области core-OS не влияет на антимикробную активность. Взятые вместе, эти данные ясно показывают, что защитная роль внешней области ядра-ОС зависит от типа ядра и различных составов сахаров.Чтобы определить наиболее эффективный AMP против одного конкретного E . coli, анализ основного типа был бы полезным и полезным перед введением AMP. Ранее для E. coli была разработана система типирования ядра LPS на основе ПЦР, которая позволяет идентифицировать тип ядра (Amor et al., 2000).

    Как было показано ранее, Cap18 очень активен против более широкого круга бактериальных патогенов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, и является многообещающим кандидатом для дальнейшего применения (Ebbensgaard et al., 2015). Чтобы лучше понять механизм действия и взаимодействия между Cap18 и OM E. coli , мы исследовали противомикробную активность ряда производных Cap18 в различных мутантных фонах E. coli с измененным внутренним ядром-OS. область, край. Наши данные показывают важность LPS для противомикробной активности Cap18 и демонстрируют, что некоторые из изначально неактивных производных Cap18 могут восстанавливать полную антимикробную активность в определенных фонах с дефицитом LPS.Основываясь на наших результатах, мы можем сделать вывод, что неповрежденная гидрофобная поверхность Cap18 играет решающую роль в антимикробной активности против E. coli ATCC25922, в частности, гидрофобных остатков I13, L17, I20, I24 и L27 (Рисунок 3) . Тестируемые производные, содержащие замену на гидрофобной поверхности (I13, L17, I20, I24, L27), можно разделить на две разные группы. Одна группа демонстрирует полную потерю антимикробной активности независимо от структуры LPS, а вторая группа производных Cap18, которые изначально были неактивны против дикого типа, но восстановили полную или частичную антимикробную активность у мутантов LPS с измененным внутренним ядром-OS. .Введение отрицательно заряженного остатка аспарагиновой кислоты в положение I13 или L17 разрушает антимикробную активность Cap18 против мутантов дикого типа и LPS независимо от внутренней структуры ядра-OS. Это говорит о том, что изменения Cap18, вызванные введением отрицательно заряженного остатка в центральном гидрофобном положении, оказывают драматическое влияние на антимикробную активность, что согласуется с нашим предыдущим исследованием, показывающим, что Cap18 I13D и L17D теряли активность против любого из протестированных микроорганизмов, независимо от того, грамположительные они или грамотрицательные (Ebbensgaard et al., 2018). Точно так же введение остатка пролина в положение L17 приведет к полной потере антимикробной активности. Напротив, антимикробная активность Cap18 I13R, в котором гидрофобный остаток заменен положительно заряженным аргинином, может быть восстановлена ​​у мутантов deep raw. Интересно, что степень антимикробной активности Cap18 I13R сильно зависит от типа мутации LPS, что предполагает, что длина усечения LPS определяет антимикробную активность Cap18 I13R.Мутант LPS, у которого отсутствует только внешняя область core-OS, более восприимчив, чем мутант без гептозы, состоящий только из минимальной единицы Kdo2-LipidA. Точно так же антимикробная активность Cap18 L17K может быть частично восстановлена ​​путем изменения внутренней структуры ядра-ОС. Интересно, что это же производное, как было показано, проявляет видоспецифичную антимикробную активность, убивая только P. aeruginosa , но не поражая Y. ruckeri, L. lactis и E. faecalis (Ebbensgaard et al.). Эти данные свидетельствуют о том, что антимикробная активность Cap18 L17K зависит от структуры бактериальной клеточной стенки. Аналогичным образом производные с заменой I20E, I20N, I24G, I24N или L27P, изначально неактивные в отношении E.coli дикого типа, восстанавливают полную или частичную активность за счет изменения структуры LPS. Подводя итог, мы предлагаем тесное взаимодействие между LPS и Cap18, которое очень специфично для тестируемой производной Cap18 и сильно зависит от структуры внутреннего ядра ОС.

    Рисунок 3 . Прогнозируемая структура Cap18. Структура Cap18 была предсказана с помощью I-Tasser (Roy et al., 2010) и визуализирована с помощью программного обеспечения CCP4 (McNicholas et al., 2011). Предсказанная α-спираль выделена красным. Зеленым цветом показаны гидрофобные остатки α-спирали. (A) Вид по оси спирали, (B) вид от N- до C-терминала, (C) вид от C- до N-терминала.

    Авторские взносы

    AE, EH и FA разработали исследование, отвечали за общий дизайн исследования и принимали участие в обсуждениях проекта.AE и HM выполнили все экспериментальные работы. Рукопись составили AE и EH. AE, HM, FA и EH внесли свой вклад в редактирование рукописи и одобрили заявку.

    Финансирование

    Исследование стало возможным благодаря финансовой поддержке со стороны Датского Министерства продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства, программы поддержки зеленого развития и демонстрации (номер гранта GUDP: 3405-10-0124) и Датского инновационного фонда (номер гранта 7045-00021B).

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Список литературы

    Амор К., Хайнрихс Д. Э., Фрирдич Е., Зибелл К., Джонсон Р. П. и Уитфилд К. (2000). Распределение основных типов олигосахаридов в липополисахаридах из Escherichia coli . Заражение. Иммун. 68, 1116–1124. DOI: 10.1128 / IAI.68.3.1116-1124.2000

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Баба Т., Ара Т., Хасегава М., Такай Ю., Окумура Ю., Баба М. и др. (2006). Конструирование Escherichia coli K-12 в рамке считывания, нокаут-мутантов по одному гену: коллекция Keio. Мол. Syst. Биол. 2: 2006.0008. DOI: 10.1038 / msb4100050

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Bociek, K., Ferluga, S., Mardirossian, M., Benincasa, M., Tossi, A., Gennaro, R., et al. (2015). Фосфорилирование липополисахаридов киназой WaaY влияет на чувствительность Escherichia coli к человеческому антимикробному пептиду LL-37. J. Biol. Chem. 290, 19933–19941. DOI: 10.1074 / jbc.M114.634758

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Браннон, Дж.R., Thomassin, J. L., Desloges, I., Gruenheid, S., and Le Moual, H. (2013). Роль уропатогенного OmpT Escherichia coli в устойчивости к человеческому кателицидину LL-37. FEMS Microbiol. Lett. 345, 64–71. DOI: 10.1111 / 1574-6968.12185

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Браун В. и Рен К. (1969). Химическая характеристика, пространственное распределение и функция липопротеина (муреин-липопротеин) клеточной стенки E. coli.Специфическое влияние трипсина на структуру мембраны. евро. J. Biochem. 10, 426–438.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Chang, T.-W., Lin, Y.-M., Wang, C.-F., and Liao, Y.-D. (2012). Липопротеин внешней мембраны Lpp представляет собой грамотрицательный рецептор бактериальной клеточной поверхности для катионных антимикробных пептидов. J. Biol. Chem. 287, 418–428. DOI: 10.1074 / jbc.M111.2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Клифтон, Л.А., Чесельски, Ф., Шкода, М. В. А., Парачини, Н., Холт, С. А., и Лейки, Дж. Х. (2016). Влияние размера липополисахаридного основного олигосахарида на электростатическое связывание антимикробных белков с моделями внешней грамотрицательной бактериальной мембраны. Langmuir 32, 3485–3494. DOI: 10.1021 / acs.langmuir.6b00240

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Коулз, К. Э., Ли, Ю., Земмельхак, М. Ф., Кристя, И. М., и Силхави, Т. Дж. (2011).Свободные и связанные формы Lpp занимают разные субклеточные местоположения в Escherichia coli . Мол. Microbiol. 79, 1168–1181. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2011.07539.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Даценко, К. А., Ваннер, Б. Л. (2000). Одностадийная инактивация хромосомных генов в Escherichia coli K-12 с использованием продуктов ПЦР. Proc. Natl. Акад. Sci. США 97, 6640–6645. DOI: 10.1073 / pnas.120163297

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дэвис, С.К., Фаулер, Т., Уотсон, Дж., Ливермор, Д. М., и Уокер, Д. (2013). Годовой отчет главного врача: инфекция и рост устойчивости к противомикробным препаратам. Ланцет 381, 1606–1609. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (13) 60604-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эббенсгаард А., Мордхорст Х., Овергаард М. Т., Ареструп Ф. М. и Хансен Э. Б. (2018). Анализ антимикробной и гемолитической активности Cap18: создание производных Cap18 с повышенной специфичностью. PLoS ONE 13: e0197742. DOI: 10.1371 / journal.pone.0197742

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эббенсгаард, А., Мордхорст, Х., Овергаард, М. Т., Нильсен, К. Г., Аарструп, Ф. М., и Хансен, Э. Б. (2015). Сравнительная оценка антимикробной активности различных антимикробных пептидов против ряда патогенных бактерий. PLoS ONE 10: e0144611. DOI: 10.1371 / journal.pone.0144611

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Фрирдич, Э.и Уитфилд К. (2005). Липополисахаридная структура олигосахарида внутреннего ядра и стабильность внешней мембраны в патогенных микроорганизмах человека, принадлежащих к Enterobacteriaceae. J. Endotoxin Res. 11, 133–144. DOI: 10.1179 / 096805105X46592

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хэммерлинг, Г., Людериц, О., Вестфаль, О., и Макела, П. Х. (1971). Структурные исследования основного полисахарида Escherichia coli 0100. Eur.J. Biochem. 22, 331–344. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1971.tb01549.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хайнрихс Д. Э., Монтейро М. А., Перри М. Б. и Уитфилд К. (1998a). Система сборки липополисахарида R2 стержневого типа Escherichia coli представляет собой гибрид тех, что обнаружены в Escherichia coli K-12 и Salmonella enterica . J. Biol. Chem. 273, 8849–8859. DOI: 10.1074 / jbc.273.15.8849.

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998b). Молекулярная основа структурного разнообразия в основных областях липополисахаридов Escherichia coli и Salmonella enterica . Мол. Microbiol. 30, 221–232. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.1998.01063.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хирота Ю., Судзуки Х., Нисимура Ю., и Ясуда, С. (1977). О процессе деления клеток в Escherichia coli : мутант E. coli, лишенный муреин-липопротеина. Proc. Natl. Акад. Sci. США 74, 1417–1420.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Хритоненко В., Статопулос К. (2007). Белки омптина: расширяющееся семейство протеаз внешней мембраны грамотрицательных бактерий Enterobacteriaceae. Мол. Membr. Биол. 24, 395–406. DOI: 10.1080 / 09687680701443822

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кандж, С.С., Канафани З.А. (2011). Современные концепции противомикробной терапии против резистентных грамотрицательных организмов: бета-лактамазы расширенного спектра действия Enterobacteriaceae , устойчивые к карбапенемам Enterobacteriaceae и мультирезистентные Pseudomonas aeruginosa . Mayo Clin. Proc. 86, 250–259. DOI: 10.4065 / mcp.2010.0674

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ковата, Х., Точиги, С., Кусано, Т., и Кодзима, С. (2016). Количественное измерение проницаемости внешней мембраны у Escherichia coli lpp и мутантов tol-pal определяет значение функции Tol-Pal для поддержания устойчивости к лекарствам. J. Antibiot. 69, 863–870. DOI: 10.1038 / ja.2016.50

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Крамер, Р. А., Вандепутте-Руттен, Л., Де Рун, Г. Дж., Грос, П., Деккер, Н., и Эгмонд, М. Р. (2001). Идентификация незаменимых кислотных остатков протеазы OmpT внешней мембраны поддерживает новый активный сайт. FEBS Lett. 505, 426–430. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (01) 02863-0

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Крамер Р. А., Зандвейкен Д., Эгмонд М. Р. и Деккер Н. (2000). Фолдинг in vitro, очистка и характеристика протеазы наружной мембраны Escherichia coli OmpT. евро. J. Biochem. 267, 885–893. DOI: 10.1046 / j.1432-1327.2000.01073.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    МакНиколас, С., Поттертон, Э., Уилсон, К. С., Нобл, М. Э. М. (2011). Представляем ваши структуры: программа молекулярной графики CCP4mg. Acta Crystallogr. Разд. D Biol. Кристаллогр. 67, 386–394. DOI: 10.1107 / S047281

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Neidhardt, F., and Umbarger, H. (1996). «Химический состав Escherichia coli », в Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology , eds F.Нейдхардт, К. Р. Кертисс, Дж. И. Ингрэм, Э. К. С. Лин, К. Б. Лоу и Б. Магасаник (Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press), 13–16.

    Google Scholar

    Никайдо, Х. (1996). «Наружная мембрана» в Escherichia coli и Salmonella: Cellular and Molecular Biology , ред. Ф. Нейдхардт, CR Curtiss, JI Ingraham, ECC Lin, KB Low и B. Magasanik (Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press), 29– 47.

    Google Scholar

    Рой А., Кучукурал А. и Чжан Ю. (2010).I-TASSER: единая платформа для автоматизированного прогнозирования структуры и функции белков. Nat. Protoc. 5, 725–738. DOI: 10.1038 / nprot.2010.5

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шмидт Г., Фромм И. и Майер Х. (1970). Иммунохимические исследования основных липополисахаридов энтеробактерий разных родов. евро. J. Biochem. 14, 357–366. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1970.tb00297.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шмидт, Г., Янн, Б., и Янн, К. (1969). Иммунохимия R-липополисахаридов Escherichia coli . Различные области ядра в липополисахаридах группы O 8. Eur. J. Biochem. 10, 501–510.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Шмидт, Г., Янн, Б., и Янн, К. (1974). Генетические и иммунохимические исследования на Escherichia coli O14: K7: H-. евро. J. Biochem. 42, 303–309. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1974.tb03340.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шнек, Э., Шуберт Т., Коновалов О.В., Куинн Б.Э., Гуцманн Т., Бранденбург К. и др. (2010). Количественное определение распределения ионов в бактериальных липополисахаридных мембранах с помощью рентгеновской флуоресценции скользящего падения. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 9147–9151. DOI: 10.1073 / pnas.0

    7107.

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Штумпе С., Шмид Р., Стивенс Д. Л., Георгиу Г. и Баккер Э. П. (1998). Идентификация OmpT как протеазы, которая гидролизует антимикробный пептид протамин до того, как он попадет в растущие клетки Escherichia coli . J. Bacteriol. 180, 4002–4006.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Сугимура К. и Нишихара Т. (1988). Очистка, характеристика и первичная структура протеазы VII Escherichia coli со специфичностью для парных основных остатков: идентичность протеазы VII и OmpT. J. Bacteriol. 170, 5625–5632.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Судзуки, Х., Нисимура, Ю., Ясуда, С., Нисимура, А., Ямада, М., и Хирота, Ю.(1978). Муреин-липопротеин Escherichia coli : белок, участвующий в стабилизации оболочки бактериальной клетки. MGG Mol. Genet Genet. 167, 1–9. DOI: 10.1007 / BF00270315.

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Томассен, Дж. Л., Браннон, Дж. Р., Гиббс, Б. Ф., Грюнхайд, С., и Ле Муаль, Х. (2012). Протеазы внешней мембраны OmpT энтерогеморрагической и энтеропатогенной Escherichia coli по-разному участвуют в деградации человеческого LL-37. Заражение. Иммун. 80, 483–492. DOI: 10.1128 / IAI.05674-11

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ваара, М. (1993). Чувствительные к антибиотикам мутанты Escherichia coli и Salmonella typhimurium . Антимикробный. Агенты Chemother. 37, 2255–2260.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Виноградов Э. В., Ван дер Дрифт К., Томас-Оутс Дж. Э., Мешков С., Брейд Х., Холст О.(1999). Структуры углеводных скелетов липополисахаридов из шершавых мутантов Escherichia coli F470 (тип ядра R1) и F576 (тип ядра R2). евро. J. Biochem. 261, 629–639. DOI: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00280.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Виклер М. А., Кокерилл Ф. Р., Буш К., Дадли М. Н., Элиопулос Г. М., Харди Д. Дж. И др. (2009). «Методы разведения» тестов на чувствительность к противомикробным препаратам для бактерий, которые растут в аэробных условиях; Утвержденный стандарт, 8-е издание .Уэйн, Пенсильвания: Институт клинических и лабораторных стандартов

    Google Scholar

    Йетон, Дж. А., Хайнрихс, Д. Э., Монтейро, М. А., Перри, М. Б., и Уитфилд, К. (1998). Участие waaY, waaQ и waaP в модификации липополисахарида Escherichia coli и их роль в формировании стабильной внешней мембраны. J. Biol. Chem. 273, 26310–26316 DOI: 10.1074 / jbc.273.41.26310

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    4.4B: грамотрицательная внешняя мембрана — Biology LibreTexts

    1. Последнее обновление
    2. Сохранить как PDF
    1. Ключевые моменты
    2. Ключевые термины

    Цели обучения

    • Распознать характеристики грамотрицательных бактерий

    Стенка грамотрицательных клеток состоит из внешней мембраны, слоя пептидоглигана и периплазмы .

    Рисунок: Структура грамотрицательной клеточной стенки : грамотрицательная внешняя мембрана, состоящая из липополисахаридов.

    У грамотрицательных бактерий клеточная стенка состоит из одного слоя пептидогликана, окруженного мембранной структурой, называемой внешней мембраной. Грамотрицательные бактерии не сохраняют кристаллический фиолетовый, но способны сохранять контрастное пятно, обычно сафранин, который добавляется после кристаллического фиолетового. Сафранин отвечает за красный или розовый цвет, который наблюдается у грамотрицательных бактерий.Клеточная стенка грамотрицательных бактерий тоньше (10 нанометров) и менее компактна, чем у грамположительных бактерий, но остается прочной, жесткой и эластичной, что придает им форму и защищает от экстремальных условий окружающей среды. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий неизменно содержит уникальный компонент, липополисахарид (ЛПС) в дополнение к белкам и фосфолипидам. Молекула LPS токсична и классифицируется как эндотоксин, который вызывает сильный иммунный ответ, когда бактерии заражают животных.

    У грамотрицательных бактерий внешняя мембрана обычно рассматривается как часть внешнего листка мембранной структуры и относительно проницаема. Он содержит структуры, которые помогают бактериям прикрепляться к животным клеткам и вызывать болезни. Слой пептидогликана нековалентно прикреплен к молекулам липопротеинов, называемым липопротеинами Брауна, через их гидрофобную головку. Между внешней мембраной и плазматической мембраной зажат концентрированный гелеобразный матрикс (периплазма) в периплазматическом пространстве.Фактически, он является неотъемлемой частью грамотрицательной клеточной стенки и содержит белки, связывающие аминокислоты, сахара, витамины, железо и ферменты, необходимые для питания бактерий. Периплазматическое пространство может действовать как резервуар для факторов вирулентности и динамического потока макромолекул, представляющих метаболический статус клетки и ее реакцию на факторы окружающей среды. Вместе плазматическая мембрана и клеточная стенка (внешняя мембрана, слой пептидогликана и периплазма) составляют грамотрицательную оболочку.

    Ключевые моменты

    • Наружная мембрана грамотрицательных бактерий содержит липополисахариды, белки и фосфолипиды.
    • Липополисахаридный компонент действует как фактор вирулентности и вызывает болезни у животных.
    • Больше факторов вирулентности скрывается в периплазматическом пространстве между внешней мембраной и плазматической мембраной.

    Ключевые термины

    • липополисахарид : любой из большого класса липидов, конъюгированных с полисахаридами
    • эндотоксин : Любой токсин, выделяемый микроорганизмом и высвобождающийся в окружающую среду только после его смерти.

    Разработка бактериальных везикул наружной мембраны как трансдермальных наноплатформ для терапии меланомы, запрограммированной с помощью фото-TRAIL

    ВВЕДЕНИЕ

    Меланома — это агрессивный рак с быстрым прогрессированием, быстрым рецидивом и высоким уровнем метастазов. Фотообработка, которая вызывается взаимодействием ближнего инфракрасного (NIR) света и фотосенсибилизатора (PTS), такого как индоцианин зеленый (ICG), для удаления сфероидов опухоли, широко используется для лечения меланомы кожи.Однако из-за ограниченного проникновения NIR-света и плохой специфичности PTS опухолевые массы на глубоких участках кожи и на краях после фотообработки часто приводят к быстрому рецидиву и метастазированию меланомы ( 1 ). Разработка эффективной стратегии, которая может помочь фотообработке уничтожить как первичные опухолевые сфероиды, так и диссеминированные опухолевые массы, имеет решающее значение для улучшения противоопухолевых свойств.

    Рекомбинантный лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с фактором некроза опухоли человека (TRAIL), представляет собой белок, привлекающий большое внимание в терапии рака из-за его специфичности в индукции апоптоза раковых клеток с минимальной токсичностью для нормальных клеток.Однако клинические исследования показали ограниченную терапевтическую эффективность TRAIL даже в сочетании с химиотерапией. Это связано с тем, что полезность терапии на основе TRAIL зависит от снижения резистентности к TRAIL ( 2 ).

    В этом исследовании мы разработали комбинированное использование NIR раздражения и TRAIL, чтобы исследовать, достаточно ли фотообработки для перевода TRAIL-устойчивых опухолевых клеток в чувствительное состояние. Поскольку белки имеют большой молекулярный вес и подвержены деградации, их сложно доставить с помощью обычных стратегий доставки ( 3 ).В последние несколько лет везикулы бактериальной внешней мембраны (OMV) широко исследовались в качестве биотерапевтических средств и / или биомиметических носителей. В частности, было показано, что OMV, полученные из Escherichia coli , которые трансформируются генами-мишенями, обладают уникальной функцией включения нацеливающего белка, что делает их перспективными для доставки белка ( 4 ). Кроме того, недавно сообщалось о том, что OMV бактериального происхождения вызывают гипертермию при раздражении в ближней инфракрасной области ( 5 ), что подчеркивает способность OMV для применения в фототермической терапии.

    Меланома — актуальное заболевание, при котором опухолевые массы локализуются на границе эпидермиса и дермы. Трансдермальная доставка лекарств представляет собой привлекательный подход, который позволяет доставлять внешние терапевтические молекулы непосредственно к месту меланомы. Однако роговой слой (РС) образует большой барьер, исключающий проникновение через кожу внешних биомакромолекул. Для улучшения проникновения через кожу использовался широкий спектр физических устройств и синтетических наночастиц ( 6 ). Однако сложность физических устройств, таких как электропорация, затрудняет их клиническое применение.Лишь несколько синтетических наночастиц прошли клинические испытания, поскольку большинство из них связано с токсичностью, связанной с материалом, низкой эффективностью улавливания лекарств, плохим клиренсом и высокой стоимостью пилотного производства. Трансдермальная платформа, которая эффективно преодолевает SC-барьер с высокой безопасностью, еще не разработана.

    Разлагаемые OMV, с их наноразмером и поверхностным сходством с клеточной мембраной, как полагают, обладают большим потенциалом проникновения через SC. В недавнем исследовании Карвахал и его коллеги ( 7 ) исследовали проникновение через кожу OMV, полученных из растений, и показали, что OMV, захваченные флуоресцеином, имеют диаметр 361.28 нм могут успешно проникать в СК и накапливаться в дерме. Здесь мы сконструировали трансгенный штамм E. coli (T– E. coli ), трансформированный плазмидной ДНК, кодирующей ген TRAIL (pDNAs-TRAIL, Homo sapiens ), из которого мы выделили OMV. Затем эти OMV были модифицированы синтезированным лигандом, нацеленным на интегрин α v β 3 (RGP) ( 8 ) и ICG, образуя резервуар (I-P-OMV) как для TRAIL, так и для ICG с эффектом нацеливания на опухоль.Конструирование IP-OMV и их индуцированное фото-TRAIL-программированное лечение (PTPT) при меланоме кожи после местного применения показано на рис. 1. Ожидается, что IP-OMV после нанесения на участок меланомы кожи проникнут через SC и нацелены на меланому. через специфическое связывание между RGP и интегрином α v β 3 на поверхности клеток меланомы. При раздражении NIR ICG отделяется от I-P-OMV, вызывая интерференцию пероксидазы-антипероксидазы (PAP), которая быстро очищает первичные сфероиды опухоли.Раздражение NIR также стимулирует высвобождение TRAIL из OMV, которое активирует апоптоз в диссеминированных опухолевых массах. Ожидается, что с помощью этого PTPT на основе I-P-OMV + NIR меланома кожи будет полностью искоренена, а рецидив и метастазирование могут быть отсрочены. Это первый случай использования фотообработки для сенсибилизации устойчивых опухолевых клеток к TRAIL, что может иметь большой потенциал для создания синергетических противоопухолевых свойств для полного искоренения меланомы кожи.

    Инжир.1 Схематический дизайн и терапевтическая стратегия I-P-OMV + NIR.

    Часть I: Подготовка I-P-OMV. (i) Трансформация E. coli с помощью pDNA-TRAIL (T– E. coli ). (ii) Выделение OMV из T– E. coli . (iii) Детоксикация OMV лизоцимом. (iv) Модификация OMV с помощью RGP, образующего P-OMV. (v) Конъюгация ICG с P-OMV с образованием I-P-OMV. Часть II: Местное применение I-P-OMV вызывает лечение фото-TRAIL при меланоме кожи. (i) I-P-OMV проникают через кожу и нацелены на меланому.(ii) Раздражение NIR запускает ICG, чтобы вызвать эффект гипертермии и секретировать синглетный кислород, который быстро очищает первичные сфероиды меланомы. (iii) Фототермический эффект вызывает деформацию OMV, которые высвобождают TRAIL, с последующим их связыванием с рецепторами смерти на поверхности клеток меланомы, активируя апоптоз в остаточных клетках меланомы. (iv) лечение I-P-OMV + NIR предотвращает метастатический потенциал меланомы путем вмешательства в соответствующие гены и белки.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Синтез и характеристика α

    v β 3 нацеленный на интегрин пептид

    α v β 3 интегрин отсутствует в нормальных меланоцитах, но сверхэкспрессируется в инвазивных меланомах, что делает его перспективной мишенью для разработки лиганд, нацеленный на меланому.В этом исследовании мы разработали интегрин-специфический пептид α v β 3 , RGP (RWrNMGGGGIVRADRAAVP), который, как было показано, имеет значительно более высокую аффинность связывания с оценкой стыковки -20,592 и более низкой свободной энергией связывания — 230,26 ккал / моль, чем у аргинилглициласпарагиновой кислоты (RGD). Кроме того, RGP образует водородные связи и гидрофобные взаимодействия с субъединицей α v β 3 (рис. S1A). Он также самопроизвольно образует α-спираль в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рис.S1B), что указывает на его большой потенциал в качестве специфического интегринового лиганда α v β 3 . Сигмоидальные кривые связывания RGP и RGD были подогнаны, и значения их констант диссоциации были рассчитаны как 1,54 и 5,49 нМ, соответственно, что демонстрирует значительно более высокую аффинность связывания RGP с α v β 3 интегрином (фиг. S1C).

    Кроме того, RGP практически не разлагается в 50% -ной эмбриональной телячьей сыворотке (FBS), что свидетельствует о его способности оставаться стабильным in vivo (рис.S1D). Чтобы определить специфичность RGP для интегрина α v β 3 , мы сравнили аффинность связывания RGP и RGD с линией клеток меланомы (B16F10) со сверхэкспрессией α v β 3 интегрина и нормальной клеточной линией гепатоцитов ( L02) с низкой экспрессией α v β 3 интегрина ( 9 , 10 ). В отличие от слабого связывания меченного родамином B RGP (RhB-RGP) или RGD (RhB-RGD) с клетками L02, связывание RhB-RGP и RhB-RGD с клетками B16F10 было значительно усилено (рис.S1E). Более того, RhB-RGP генерировал в 6,3 раза более высокую интенсивность флуоресценции в клетках B16F10, чем флуоресценция, генерируемая RhB-RGD, что подчеркивает значительно повышенную специфичность RGP к интегрину α v β 3 . Кроме того, RGP практически не вызывает потери жизнеспособности клеток даже при высокой концентрации 100 мкМ, что указывает на его умеренную токсичность (рис. S1F). Эти результаты вместе продемонстрировали превосходную эффективность нацеливания на интегрин, высокую стабильность и хорошую биосовместимость RGP, предполагая его большой потенциал для применения нацеливания на интегрин α v β 3 in vivo.

    Конструирование и характеристика IP-OMV

    Для конструирования IP-OMV мы сначала трансформировали плазмидную ДНК, кодирующую функциональный домен TRAIL (аминокислоты 114–281, H. sapiens ) в штамм E. coli . образуя T– E. coli ) ( 11 ). Карта pDNA-TRAIL показана на рис. S2A. На рис. 2A, E. coli T– секретировала большое количество OMV, которые затем были выделены и очищены с помощью ультрацентрифуги. OMV размером менее 100 нм собирали и детоксифицировали лизоцимом для дальнейшего использования.Сильная красная флуоресценция наблюдалась для OMV, окрашенных CELLTRACKER ™ CM-Dil (названных Dil-OMV), что указывает на липидную мембрану OMV (фиг. 2B). Средний диаметр OMV составлял 94,54 ± 1,46 нм с протеиндисульфидизомеразой и дзета-потенциалами 0,21 ± 0,01 мВ и -22,13 ± 0,85 мВ, соответственно (фиг. 2C). Чтобы проверить встраивание белка TRAIL в OMV, мы идентифицировали как приготовленные OMV, так и штамм T– E. coli с помощью Вестерн-блоттинга (WB). На рис. 2D белок TRAIL был обнаружен внутри сконструированного T– E.coli и производные от него OMV (рис. 2D). Кроме того, TRAIL не был обнаружен в пределах предкового штамма E. coli и производных от него OMV. Используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), мы определили концентрацию TRAIL в OMV, полученных из T– E. coli , как OMV (583,57 ± 10,6 пг / мкг; сырой вес). Затем RGP и RGD были конъюгированы с OMV с использованием пальмитиновой кислоты, образуя RGP-OMV (P-OMV) и RGD-OMV (R-OMV), соответственно (фиг. S2A). Конъюгация подтверждена методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (рис.S2B). Конъюгированные плотности RGP и RGD по отношению к OMV составляли 12,92 ± 5,85% и 10,25 ± 4,57%, соответственно. Наконец, ICG был загружен в три вида OMV посредством эффекта слияния и электростатического взаимодействия с RGD / RGP, образуя ICG-OMV (I-OMV), ICG-RGD-OMV (IR-OMV) и ICG-RGP-OMV. (IP-OMV) соответственно (рис. S2B). Эффективность загрузки ICG в OMV оптимизирована как OMV (7,4 ± 0,9 мкг / мкг; влажный вес). Также было показано, что конъюгация ICG, RGP и RGD не влияла на размер частиц (рис.2E), дзета-потенциал (фиг. 2F) и морфология OMV (фиг. 2G).

    Рис. 2 Конструкция и характеристика I-P-OMV.

    ( A ) ПЭМ-изображения T– E. coli с их производными OMV. Масштабные линейки 2 мкм и 200 нм. ( B ) Изображение Dil-OMV, полученное с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Шкала 2 мкм. ( C ) Распределение размеров OMV, измеренное с помощью DLS. ( D ) WB-анализ белка S3 (классический белок, содержащийся в пределах E.coli ) и белок TRAIL в бактериальных клетках и производных от них OMV. GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. ( E ) Распределение по размерам и ( F ) дзета-потенциал (ZP) OMV, R-OMV и P-OMV. ( G ) ТЕМ-изображения OMV, R-OMV и P-OMV. Масштабные линейки, 200 нм.

    Чтобы действовать как наноплатформы для доставки ICG и белка, мы затем оценили воспалительный потенциал OMV. Известно, что липополисахарид (ЛПС) является основным компонентом внешней мембраны грамотрицательных бактерий, которые могут вызывать воспаление у хозяев ( 12 ).Однако лизоцим может связываться с бактериальным LPS с высоким сродством, и полученный комплекс может ингибировать воспалительные реакции ( 13 ). Поэтому в этом исследовании мы использовали лечение лизоцимом для детоксикации OMV. Мы измерили уровни воспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6) в макрофагах (RAW264.7), инфицированных OMV или детоксифицированных OMV. Мы наблюдали, что уровни TNF-α и IL-6 были намного ниже в макрофагах, обработанных детоксифицированными OMV, по сравнению с макрофагами с интактными OMV (рис.S2C). Чтобы оценить воспаление in vivo, мы местно применяли OMV к мышам и исследовали воспалительный ответ, индуцированный OMV in vivo. Вкратце, мышей, которым внутрибрюшинно вводили ЛПС, были выбраны в качестве положительного контроля. Мы наблюдали, что концентрации TNF-α и IL-6 были значительно ниже у мышей, получавших детоксифицированные OMV, по сравнению с таковыми у мышей, получавших LPS (рис. S2D). Эти результаты продемонстрировали, что детоксикация с помощью лизоцима была эффективной для удаления большинства вызывающих воспаление компонентов OMV, что сделало OMV безопасным инструментом для биологических применений как in vitro, так и in vivo.

    PAP-ответ, высвобождение TRAIL и инфильтрация I-P-OMV в сфероиды меланомы

    Чтобы обеспечить PTPT при меланоме кожи, мы проверили эффективность I-P-OMV в индукции термического ответа и генерации синглетного кислорода. При раздражении NIR температура суспензии I-P-OMV быстро повышалась, и этот эффект нагрева сохранялся (фиг. 3A). Реакция I-P-OMV на раздражение NIR была значительно выше, чем у свободных ICG (рис. S3A). Например, в дозе 0.5 мкг / мл, I-P-OMV повышали температуру с 25 до 40 ° C в течение 3 минут. Напротив, свободный ICG (1 мкг / мл) увеличивал температуру только с 25 до 35 ° C. Этому может способствовать усиленный фототермический эффект I-P-OMV; использование P-OMV в качестве резервуара повышает стабильность и доступность ICG. Хорошо известно, что когда клеточная температура превышает 39 ° C, белки начинают денатурировать ( 14 ). Доклинические исследования показали, что нагревание выше 43 ° C может вызвать серьезное повреждение раковых клеток; следовательно, большинство методов лечения теплового рака устанавливают температуру в диапазоне от 41 до 50 ° C (так называемый клинически значимый диапазон температур) ( 15 ).Тепловой эффект, вызванный I-P-OMV при раздражении NIR, продемонстрировал их большой потенциал применения для фототермической обработки. Учитывая, что на стабильность белка может повлиять высокая температура, биоактивность TRAIL была исследована при 55 и 60 ° C. Потери биоактивности как для свободного белка TRAIL, так и для белков, содержащихся в OMV, при высоких температурах не наблюдалось, что подтверждает совместное использование TRAIL с фототерапией (рис. S3B). Используя 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF), мы наблюдали сильное и дозозависимое высвобождение синглетного кислорода ( 1 O 2 ) из I-P-OMV в ответ на раздражение NIR (рис.3, Б и В). Вместе эти результаты продемонстрировали превосходную эффективность I-P-OMV в обеспечении PAP-ответа без дестабилизации TRAIL.

    Рис. 3 PAP-ответ, высвобождение TRAIL и инфильтрация I-P-OMV в сфероиды меланомы.

    ( A ) Фототермический ответ I-P-OMV (от 0 до 5 мкг / мл) на раздражение в ближней инфракрасной области (2 Вт / см 2 в течение 3 минут) ( n = 3). ( B ) Изменения в спектрах поглощения DPBF в присутствии I-P-OMV при облучении NIR (0, 0.6 и 2 Вт / см 2 ). ( C ) Поглощение DPBF в присутствии I-P-OMV при 412 нм при облучении NIR (0, 0,6 и 2 Вт / см 2 ) ( n = 3). ( D ) Профили высвобождения TRAIL при 37 ° C без или с БИК-облучением (2 Вт / см 2 ) ( n = 3). ( E ) CLSM-изображения трехмерных опухолевых сфероидов, инкубированных с Dil-OMV, Dil-R-OMV и Dil-P-OMV. ( F и G ) Интенсивность флуоресценции CM-Dil на разных глубинах трехмерных опухолевых сфероидов, инкубированных с Dil-OMV (F), Dil-R-OMV (F) и Dil-P-OMV (G).Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. *** P <0,001 и ** P <0,01.

    Ожидается, что помимо PAP-ответа, индуцируемого I-P-OMV, высвобождение TRAIL из везикул активирует апоптоз в остаточных опухолевых массах. Следовательно, используя раствор TRAIL в качестве холостого контроля, мы исследовали высвобождение TRAIL из OMV. Без NIR только около 30% TRAIL было высвобождено из OMV в течение 24 часов. Однако при раздражении NIR примерно 87% TRAIL высвобождается в течение 12 часов (рис.3D). Это повышенное высвобождение TRAIL может быть вызвано раздражением NIR, которое вызвало высокую температуру в OMV, которая вызвала конфигурацию липидных бислоев и повышенную проницаемость мембраны OMV. Однако липидный бислой OMVs остается барьером для диффузии TRAIL. Транслокация TRAIL через липидные оболочки делает окончательный профиль высвобождения устойчивым.

    Солидные опухоли состоят из опухолевых и стромальных клеток с внеклеточным матриксом (ЕСМ). Вместе они образуют трехмерное (3D) микроокружение, где клетка-клетка и клетка-ECM могут создавать множественные барьеры, через которые должны проникать терапевтические агенты ( 16 ).Чтобы предсказать эффективность взаимодействия P-OMV с целевыми клетками меланомы, мы дополнительно оценили инфильтрацию OMV в сфероиды меланомы. Мы конъюгировали OMV с флуоресцентным красителем CM-Dil и сравнили проницаемость Dil-OMV, Dil-R-OMV и Dil-P-OMV в трехмерных сфероидах меланомы. После 72 часов инкубации со сфероидами меланомы мы наблюдали только ограниченное количество Dil-OMV и Dil-R-OMV, проникающих в сфероиды с максимальной глубиной проникновения около 5 мкм (рис.3, от E до G и фильмы от S1 до S3). Однако Dil-P-OMV смогли проникнуть в сфероиды на глубину более 25 мкм. Повышенное проникновение Dil-P-OMV в опухолевые сфероиды может быть частично связано с превосходной аффинностью связывания RGP с интегрином α v β 3 . Сообщалось, что более высокая аффинность связывания лигандов с рецепторами может снизить трансцитоз наночастиц через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) ( 17 ), что может быть результатом того, что ГЭБ состоит из плотной сети клеток с высокой плотностью. соединены вместе, образуя почти непроницаемый слой.Однако, в отличие от ГЭБ, большинство опухолевых сфероидов имеют рыхлые структуры, что позволяет диффузии и проникновению частиц во внутренние слои опухолевых сфероидов. Между тем, было продемонстрировано, что после нацеливания связывания пептида с интегрином α v β 3 он будет протеолитически расщепляться протеазой, ассоциированной с клеточной поверхностью. Затем усеченный пептид теряет сродство к интегрину, вызывая глубокое проникновение связанных с ним белков в ткани опухоли ( 18 ).Кроме того, поскольку интегрин α v β 3 экспрессируется в эндотелиальных клетках опухоли, связывание Dil-P-OMV с эндотелиальными клетками опухоли также может усиливать их динамическую перфузию в сфероиде опухоли ( 19 ). Эта глубокая инфильтрация Dil-P-OMV в сфероид опухоли будет очень полезна для индукции улучшенных противоопухолевых свойств.

    Влияние лечения IP-OMV + NIR на поведение клеток меланомы

    После подтверждения эффективности IP-OMV для индукции PAP-ответа, высвобождения TRAIL и достаточной инфильтрации в трехмерные сфероиды меланомы, мы затем оценили влияние IP- OMV + NIR на биологическом поведении двух линий клеток меланомы, B16F10 и A375.Используя обработку культуральной средой в качестве холостого контроля, мы наблюдали, что не только пролиферация и инвазия клеток B16F10 и A375 ингибировались IP-OMV + NIR-индуцированной фото-TRAIL-терапией (PTPT), но и апоптоз этих опухолевых клеток был значительно преувеличен. (Рис. 4, A, B и D). Уровни разрушения PTPT клеточных линий B16F10 и A375 были аналогичными. Возьмем B16F10 в качестве примера, пролиферация клеток B16F10 показала снижение от 5 до 20% при однократной обработке I-TRAIL (смесь растворов белков ICG и TRAIL) или I-P-OMV.Однако в сочетании с раздражением в ближнем инфракрасном диапазоне скорость распространения увеличилась до 20, 30, 40 и 50% в группах I-TRAIL + NIR, I-OMV + NIR, IR-OMV + NIR и IP-OMV + NIR. соответственно (рис. 4А). Подобные результаты наблюдались при использовании анализа апоптоза. Без NIR примерно от 0,3 до 7,8% популяции клеток было апоптозным в группах, получавших I-TRAIL или I-OMV. Однако в группах I-TRAIL + NIR, I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR апоптоз был преувеличен на 3,2, 1,6, 1,5 и 1.9-кратное увеличение, соответственно, по сравнению с пациентами без раздражения NIR (рис. 4B). Поскольку для меланомы характерны высокие метастазы, далее мы исследовали влияние ПТПТ на инвазию меланомы. По сравнению с холостым контролем инвазионная способность клеток меланомы в группах, обработанных I-TRAIL–, I-OMV–, IR-OMV– и IP-OMV, снизилась до 76, 55, 31 и 20% от таковой в группах пустой контроль соответственно (фиг. 4С). При раздражении NIR инвазия I-TRAIL + NIR–, I-OMV + NIR–, I-R-OMV + NIR– и I-P-OMV + NIR-обработанные клетки уменьшалась на 1.В 1, 1,4, 1,6 и 1,3 раза, соответственно, по сравнению с пациентами без NIR, соответственно (рис. 4D).

    Рис. 4 Влияние I-P-OMV + NIR на поведение клеток меланомы.

    ( A и B ) Жизнеспособность (A) и процент апоптоза (B) клеток B16F10 и A375 до и после лечения ( n = 6). ( C ) Инвазия клеток B16F10 и A375 до и после лечения ( n = 6). ( D ) Кинетика миграции клеток до и после лечения, как показывает непрерывный мониторинг миграции живых клеток.Показанные результаты представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3). (E) Изменения уровней конвертирующего фермент-ингибирующего белка (c-FLIP) и мРНК сурвивина в клетках B16F10 в контрольной группе, I-P-OMV, ICG + NIR и I-P-OMV + NIR группах ( n = 3). ( F и G ) WB-анализ (F) и количественные уровни (G) c-FLIP, сурвивина, расщепленной каспазы 3 и расщепленной каспазы 8 в тестируемых клетках ( n = 3). Все пустые группы обозначают клетки, обработанные культуральной средой. Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение.*** P <0,001, ** P <0,01 и * P <0,05.

    Хорошо известно, что устойчивость опухолевых клеток к TRAIL отчасти обусловлена ​​сверхэкспрессией молекул, ингибирующих апоптоз, клеточного Fas-ассоциированного белка домена смерти, такого как IL-1β, превращающего фермент-ингибирующий белок (c-FLIP) и ингибитора белки апоптоза (IAP) (т.е. сурвивин) ( 20 ), а также отсутствие экспрессии каспаз 3 и 8 ( 21 ). Чтобы проверить, может ли раздражение NIR переводить TRAIL-резистентные клетки меланомы в чувствительное состояние, мы исследовали уровни c-FLIP и IAP в клетках при различных обработках.Одни только I-P-OMV не показали значительного влияния на c-FLIP и сурвивин в клетках B16F10 (фиг. 4E). Однако c-FLIP и сурвивин снизились до 63 и 56% в группе ICG + NIR и до 52 и 28% в группе I-P-OMV + NIR. В отличие от холостых клеток, экспрессия белков c-FLIP и сурвивина в клетках, обработанных I-P-OMV + NIR, также снизилась в 5,1–7,5 раз. С механической точки зрения c-FLIP представляет собой термочувствительный белок, нацеливание которого гипертермией позволяет восстановить апоптоз, индуцированный TRAIL. Сообщалось, что как митохондриально-зависимый путь, который увеличивает деградацию c-FLIP ( 22 ), так и митохондриально-независимый путь, который ускоряет агрегацию и исчезновение c-FLIP из цитозоля, вызванный эффектами гипертермии, способствуют восстановлению TRAIL. -индуцированный апоптоз ( 23 ).Фототермический эффект, индуцированный I-P-OMV + NIR, поэтому может быть важным механизмом для эффективного подавления экспрессии гена и белка c-FLIP. Сурвивин является основным членом семейства IAP, который играет важную роль в ингибировании активации каспаз. Используя сурвивин в качестве маркера, мы оценили влияние I-P-OMV + NIR на IAP в B16F10. Мы наблюдали, что продукция сурвивина значительно снижалась при лечении I-P-OMV + NIR (рис. 4, от E до G). Основной механизм может быть частично объяснен тем фактом, что I-P-OMVs + NIR-индуцированные эффекты PAP могут предотвращать связывание сурвивина с X-связанным IAP (XIAP) ( 24 ).Также оценивали расщепленные каспазы 3 и 8, два белка, которые подавлялись c-FLIP и IAP. Уровень расщепленной каспазы 3 увеличился в 2,4 и 3,7 раза после лечения ICG + NIR и I-P-OMV + NIR, соответственно. Уровень расщепленной каспазы 8 увеличивался обработкой ICG + NIR и I-P-OMV + NIR в 3,3 и 5,1 раза соответственно (рис. 4G). Эти результаты представляют собой убедительные доказательства, указывающие на то, что воздействие ближнего инфракрасного излучения может значительно повысить чувствительность клеток меланомы к белку TRAIL; поэтому улучшенные противоопухолевые свойства были достигнуты за счет комбинированного использования TRAIL и NIR раздражения.

    Изменения клеточных генов и белков в ответ на лечение I-P-OMV + NIR

    Повышенное противоопухолевое действие, проявляемое обработкой I-P-OMV + NIR, напомнило нам об исследовании лежащего в основе механизма. Используя обработку культуральной средой в качестве холостого контроля, мы таким образом выполнили секвенирование мРНК, количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (qRT-PCR) и валидацию WB профилей транскрипции клеток B16F10 после обработки I-P-OMV + NIR. Кластерограмма генов, которые дифференциально экспрессировались в B16F10 после обработки, была получена путем секвенирования мРНК (рис.5А). Было показано, что в общей сложности 574 мРНК значительно изменились после PTPT ( P ≤ 0,05). Используя двукратное изменение и значения P и q при 0,00 в качестве стандарта, было показано, что 68 и 96 мРНК подвергаются повышающей и понижающей регуляции в обработанных клетках, соответственно (фиг. 5B). Вкратце, пролиферация без зависимости от факторов роста, репликация без ограничений, уклонение от апоптоза, инвазии и поддержка ангиогенеза являются типичными процессами, вовлеченными в генез опухоли ( 25 ).На основе их функций, связанных с активностью генеза опухоли, 45 классических генов, соответствующих ингибированию роста, стимуляции апоптоза ( 26 ), замедлению инвазии ( 27 ) и подавлению неоваскуляризации ( 28 ), были разделены на категории (рис. 5C). ). Результаты анализа чипа мРНК были подтверждены путем изучения ключевых генов и белков, которые регулируют апоптоз и метастазирование меланомы. В-клеточная лимфома-2 (Bcl-2) является одним из маркеров митохондриального апоптоза. Ниже контрольной точки Bcl-2 индуцируются две основные программы выполнения, включая каспазный путь и дисфункцию митохондрий.Путь каспазы, состоящий из двух больших и двух малых субъединиц, которые расщепляют субстраты смерти [т.е. поли (аденозин-5′-дифосфат-рибоза) полимераза (PARP)], в конечном итоге приводит к гибели клеток ( 29 ). Чтобы проверить митохондриальный апоптоз, мы проанализировали экспрессию Bcl-2, расщепленной каспазы 3 и PARP в клетках.

    Рис. 5. Генетические и белковые изменения клеток в ответ на I-P-OMV + NIR.

    ( A и B ) Иерархическая кластеризация (A) и графики вулканов (B) дифференциально регулируемых генов, идентифицированных при q <0.05 в ячейках B16F10. ( C ) Категоризация дифференциально экспрессируемых генов. ( D ) Ген Bcl-2 в тестируемых клетках B16F10 ( n = 3). ( E и F ) WB (E) и объединенные данные (F) по уровням расщепленной каспазы 3 и расщепленного белка PARP в тестируемых клетках B16F10 ( n = 3). ( G ) Гены E-кадгерина и виментина в тестируемых клетках B16F10. ( H и I ) WB (H) и объединенные данные (I) об уровнях белка E-кадгерина и виментина в тестируемых клетках B16F10 ( n = 3).( J ) Уровень WB белка Caveolin-1 (Cav-1) в тестируемых клетках или производных от них OMV ( n = 3). ( K ) WB мезенхимально-эпителиального перехода (MET) и уровень белков Rab27A в тестируемых клетках или производных от них OMV ( n = 3). ( L N ) Объединенные данные об уровнях белка Rab27A (L), Cav-1 и MET (M и N) в тестируемых клетках или производных от них OMV ( n = 3). I и II представляют собой холостые и I-P-OMV + NIR группы соответственно.Все пустые группы обозначают клетки, обработанные культуральной средой. ( O ) Схематическое изображение изменений в генах, связанных с апоптозом и метастазами, при I-P-OMV + NIR. Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. *** P <0,001 и ** P <0,01.

    Показано, что потеря E-кадгерина и увеличение виментина связаны с усилением инвазии, что приводит к более высокому метастазированию опухоли ( 30 ). Е-кадгерин, трансмембранный гликопротеин, участвующий в межклеточной адгезии, является хорошо известным белком-супрессором метастазов опухоли ( 31 ).Виментин положительно коррелирует с метастазированием. Кроме того, все больше данных демонстрирует, что OMV, полученные из опухолевых клеток, вызывают неплотность сосудов, рекрутирование клеток-предшественников костного мозга и метастазирование посредством прямого контакта с клетками меланомы и косвенного взаимодействия со стромой ( 32 ). Протеомный анализ опухолевых OMV выявил отличительные молекулярные паттерны корреляции с метастазированием [то есть повышающая регуляция мезенхимально-эпителиального перехода (MET) и Rab27A ( 33 ) и понижающая регуляция Caveolin-1 (Cav-1) ( 34 )].

    Чтобы проверить молекулярное вмешательство I-P-OMV + NIR в апоптоз и метастазирование меланомы, мы исследовали изменения вышеуказанных генов и белков в B16F10 и / или производных от них OMV. На рис. 5 (D к N), в отличие от холостых клеток, обработка IP-OMV + NIR значительно снижала уровни Bcl-2, виментина и MET с 1,6, 1,7 до 1,9 и 1,5 до В 1,8 раза, соответственно, в обработанных клетках B16F10 или производных от них OMV. I-P-OMV + NIR также увеличивали уровни расщепленной каспазы 3, расщепленного PARP, E-кадгерина и Cav-1 в обработанных клетках или OMV с 4.1-, 10,6-, 2,4-2,8 и 1,9-2,1 раза соответственно. Rab27A отвечает за создание проинвазивных OMV. Потеря Rab27A изменяет состав OMV и количество белков OMV. На рис. 5 (K и L) I-P-OMV + NIR значительно снижает уровень белка Rab27A в OMV, полученных из меланомы, в 1,5 раза. Схематическая иллюстрация индуцированного I-P-OMV + NIR молекулярного вмешательства в апоптоз и метастазирование меланомы обобщена на рис. 50 и в таблице S1. Эти результаты вместе продемонстрировали, что I-P-OMV + NIR проявляют комплексную регуляцию в молекулярной сети апоптоза и метастазирования клеток меланомы, что приводит к усиленному апоптотическому и антиметастазному эффектам на меланому.Превосходная эффективность лечения IP-OMV + NIR в регулировании путей передачи сигнала при меланоме может быть связана с тем, что эффекты PAP могут переключать резистентную меланому в чувствительное состояние, а также увеличивают циркуляцию и взаимодействие ICG и TRAIL с опухолью. ячеек ( 35 ).

    Трансдермальная доставка и противоопухолевые свойства I-P-OMV + NIR

    Для разработки OMV в платформах трансдермальной доставки мы проверили их эффективность в проникновении SC как in vitro, так и in vivo.Мы использовали OMV, полученные из pDNA – зеленый флуоресцентный белок (GFP) – трансформированный E. coli (OMVs-GFP), для мониторинга проникновения OMV через кожу. Свободный флуоресцентный белок, меченый флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), бычий сывороточный альбумин (FITC-BSA) был неспособен проникать через SC, так как флуоресценция не наблюдалась (рис. S4A). Напротив, сильная флуоресценция GFP наблюдалась в SC, эпидермисе и дерме после местного применения OMVs-GFP, R-OMVs-GFP и P-OMVs-GFP (рис. 6A). Трансдермальное количество свободного белка TRAIL было слишком низким, чтобы его можно было обнаружить (рис.6Б). Однако при использовании OMV, R-OMV и P-OMV в качестве носителей трансдермальные концентрации TRAIL заметно увеличивались в течение первых 2 часов. Самые высокие концентрации наблюдались примерно через 10 часов после обработки. Эта повышенная эффективность OMV в переносе белка через SC подчеркивает, что OMV являются идеальным носителем для трансдермальной доставки белка. Эти результаты явились прямым доказательством проникновения OMV через кожу. Более того, интегрин α v β 3 может экспрессироваться только на кровеносных сосудах в грануляциях ран, сосудах новорожденных и эндотелиальных клетках опухоли, но не в нормальной коже, системах органов или покоящихся эндотелиальных клетках ( 36 ).Поскольку OMV, модифицированные RGP или RGD, мало влияют на проникновение этих пузырьков в кожу, OMV, R-OMV и P-OMV показали аналогичную трансдермальную эффективность (рис. 6, A и B).

    Рис. 6. Трансдермальная доставка I-P-OMV и противоопухолевые характеристики I-P-OMV + NIR.

    ( A ) Распределение OMV-GFP, R-OMV-GFP и P-OMV-GFP в срезе кожи. Масштабные линейки, 100 нм. ( B ) Накопленные трансдермальные количества белка TRAIL ( n = 3).( C ) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) (c 1 ) и ПЭМ (c 2 , c 3 и c 4 ) изображения тканей кожи после местного применения DiI-P-OMV. Масштабные линейки, 1 мкм. DiI (1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат) –P-OMV указаны красными стрелками. ( D ) Схематическое изображение распределения OMV в коже и их трансдермальных путей. ( E ) Визуализация флуоресценции in vivo мышей с опухолью после местного применения Dil-P-OMV.( F ) Флуоресцентные изображения опухолей и основных органов ( G ) Терапевтический режим I-P-OMV + NIR у мышей с меланомой B16F10. (От H до J ) Размер опухолей, частота рецидивов и масса тела у мышей в течение тестируемых периодов. ( K ) TUNEL (мечение ник-концов дезоксиуридинтрифосфата, опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой), расщепленная каспаза 3, Fontana-Masson (12 часов, 6-й и 12-й день), S100-β (12-й день) и CD63 ( 12 день) окрашивание опухолей.( L R ) Количественная оценка (K) -положительных клеток в опухолях ( n = 3). Масштабные линейки, 100 нм. I-V представляют группы ICG + NIR, I-TRAIL + NIR, I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR, соответственно. Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. *** P <0,001, ** P <0,01 и * P <0,05. n.s., не имеет значения.

    Превосходная эффективность OMV в проникновении через кожу вдохновила нас на изучение основных трансдермальных механизмов.Есть два пути трансдермального проникновения внешних частиц. Один из них — это физический канал придатков кожи. Эти каналы имеют диаметр в микронах, через которые везикулы нанометрового размера могут проходить в глубокий слой кожи ( 37 ). Здесь мы показали, что OMV могли проникать через SC и распространяться по коже и путям придатков, таких как наружные корневые оболочки, сальные железы и волосяные луковицы, что указывает на то, что OMV могут проникать через SC через фолликулы (рис.6C и рис. S4B). Механически предполагается, что после местного нанесения OMV на кожу они проникают через покрытие «богатый липидами канал» на волосяные фолликулы. OMV могут добраться до стержней волос двумя способами ( 38 ). Один из них заключается в том, что везикулы проникают в клетки матрикса волос, а затем перемещаются к стержням волос путем дифференцировки и роста волос. Другой способ — через прямое проникновение в стержни волос с кончика волоса или со стороны стержня волос, поскольку каналы волосяных фолликулов имеют размер от десятков до сотен микрон ( 39 ).Проникновение микросфер через кожу трансфолликулярными путями было продемонстрировано Mordon et al. ( 40 ). Кроме того, OMV структурно напоминает липосомы (т.е. двухслойная структура фосфолипидов и гибкие диаметры) ( 41 ), о проникновении через кожу через трансфолликулы ранее сообщалось нашей группой и другими коллегами ( 42 44 ) . Все эти данные позволяют предположить, что OMV проникают через кожу через трансфолликулы.В дополнение к трансфолликулярным путям, другим важным путем проникновения в дерму через SC является проникновение в эпидермис. Для этого существуют два пути. Один из них — это трансцеллюлярный путь, по которому вещества проникают в кератиноциты и межклеточные липиды, а затем проходят через них и транспортируются. Другой путь, который, по нашему мнению, является наиболее вероятным путем, по которому лекарства проникают в SC, через извилистый путь через липиды, окружающие кератиноциты, известный как межклеточный путь ( 45 ).Из-за сходства поверхности мембраны между OMV и клетками млекопитающих OMV, как полагают, эффективны при прохождении через SC как трансцеллюлярным, так и межклеточным путями за счет эффекта слияния липидов. Кроме того, эффект гипертермии, вызванный NIR, вызывает изменение конфигурации мембраны и, следовательно, увеличивает проницаемость SC, что также может увеличивать проникновение OMV. Схематическое изображение трансдермального механизма показано на фиг. 6D.

    После проникновения через SC инфильтрация и накопление OMV в опухолевом сфероиде являются еще одним критическим фактором, влияющим на их противоопухолевые свойства.Таким образом, мы исследовали in vivo распределение меченных CM-Dil P-OMV (Dil-P-OMV) у мышей с ксенотрансплантатами опухолей, генерированных клетками B16F10. Dil-P-OMV наносили трансдермально на участок меланомы. Низкий флуоресцентный сигнал наблюдался в группе свободного Dil (рис. S4, C и D), демонстрируя плохое проникновение через кожу свободного Dil. Напротив, яркая флуоресценция наблюдалась в месте опухоли через 1, 3 и 6 часов после местного применения Dil-P-OMV (рис. 6E). Опухоль и органы собирали и наблюдали через 6 часов после лечения.Сильная флуоресценция Dil наблюдалась во всем сфероиде опухоли (фиг. 6F). Эти результаты не только продемонстрировали превосходную трансдермальную эффективность I-P-OMV, но также подтвердили эффективное нацеливание на опухоль и инфильтрацию I-P-OMV в сфероиды меланомы in vivo.

    На основе превосходной трансдермальной эффективности I-P-OMV и их многообещающих противоопухолевых свойств in vitro мы затем исследовали влияние PTPT на меланому кожи in vivo. Мы провели три волны исследований на животных.В первой волне исследования мы засвидетельствовали влияние местного применения тестируемых образцов без раздражения NIR, включая ICG, I-TRAIL, IB-OMV (конъюгированные с ICG холостые OMV без включения TRAIL), IRB-OMV (ICG и RGD, объединенные бланками). OMV без встроенного TRAIL), IPB-OMV (бланковые OMV, объединенные ICG и RGP без встроенного TRAIL), I-OMV, IR-OMV и IP-OMV при меланоме кожи. Без раздражения NIR опухоли у всех протестированных мышей росли интенсивно (рис. S5A), а выживаемость мышей с 8-го дня составляет менее 20% (рис.S5B). I-TRAIL или I-OMV, IR-OMV и IP-OMV показали незначительное влияние на прогрессирование меланомы, что могло быть вызвано плохим проникновением через кожу свободного TRAIL, ограниченным высвобождением TRAIL из OMV и устойчивостью меланомы к TRAIL. . Было также продемонстрировано, что комбинированное использование OMV и раздражения в ближней инфракрасной области не вызывало потери веса у испытуемых животных (рис. S5C).

    Во второй волне лечения мы дополнительно исследовали влияние местного применения тестируемых образцов с раздражением NIR, включая ICG + NIR, I-TRAIL + NIR, I-OMV + NIR, IR-OMVs + NIR и IP- OMV + NIR при меланоме.Все протоколы режима выполнялись с такой же концентрацией TRAIL, ICG и OMV, как указано выше. Схема лечения показана на фиг. 6G. Одну дозу образца наносили трансдермально на участок опухоли за 12 часов до раздражения NIR. Затем практиковалось раздражение NIR (0,6 Вт / см 2 в течение 3 минут). Температуру участков опухоли контролировали с помощью термографической визуализации. Температура участков опухоли повысилась примерно до 32 ° C в группах ICG + NIR и I-TRAIL + NIR. Напротив, температуры в группах I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR или I-P-OMV + NIR повысились примерно до 47 ° C в течение 3 минут.Наблюдали за прогрессированием и рецидивом опухолей после лечения. Сфероиды опухоли все еще были видны в группах ICG + NIR и I-TRAIL + NIR и прогрессировали до более чем 1000 мм 3 в течение 8 дней. Напротив, в группах I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR сфероиды опухоли были полностью разрушены (фиг. 6H). Было показано, что рецидив опухоли значительно замедляется, причем наиболее сильное ингибирование наблюдается в группе I-P-OMV + NIR. Процент рецидивов опухоли на 30-й день после лечения составил 80, 80 и 40% в группах I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR, соответственно (рис.6I). В течение экспериментального периода у подопытных животных не наблюдалось потери веса (фиг. 6J). Повреждение ДНК, указывающее на апоптоз в сфероидах опухоли через 12 часов после обработки, было визуализировано с помощью анализа TUNEL (мечение ник-концов дезоксиуридинтрифосфата, опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой) (рис. 6K). Наиболее значительный апоптоз был обнаружен в местной ткани группы I-P-OMV + NIR (рис. 6L). Апоптотические сигналы также наблюдались в группах I-R-OMV + NIR и I-OMV + NIR, но их интенсивность значительно снизилась.Слабый апоптотический сигнал наблюдался в группах ICG + NIR и I-TRAIL + NIR. Таким образом, мы также подтвердили экспрессию каспазы 3 в местных тканях тестируемых групп. В отличие от низкой экспрессии расщепленной каспазы 3 в группах ICG + NIR и I-TRAIL + NIR, экспрессия расщепленной каспазы 3 была значительно увеличена в группах I-OMV + NIR, IR-OMV + NIR и I-OMV + NIR. с самым высоким уровнем, наблюдаемым в группе IP-OMV + NIR (рис. 6M). Этот результат дал дополнительные доказательства, указывающие на то, что I-P-OMV + NIR могут повышать чувствительность меланомы к TRAIL путем активации экспрессии каспазы 3.

    Меланин — типичный маркер для идентификации клеток меланомы. При использовании окрашивания по Фонтана-Массон меланин, указывающий на рецидив меланомы, наблюдался через 12 часов, 6-й и 12-й день после лечения в тестируемых группах, чтобы указать на рецидив меланомы. Уровни меланина в группах ICG + NIR, I-TRAIL + NIR и I-OMV + NIR быстро увеличивались с течением времени, что указывает на быстрое прогрессирование опухоли. У мышей, получавших I-R-OMV + NIR, меланин в местной коже наблюдался начиная с 6-го дня после лечения.Напротив, только минимальная концентрация меланина может быть идентифицирована в местной коже группы I-P-OMV + NIR на 12-й день после лечения (рис. 6, N к P). Эти результаты продемонстрировали, что рецидив меланомы можно значительно замедлить с помощью I-P-OMV + NIR. Влияние лечения I-P-OMV + NIR на метастатический потенциал сфероидов опухоли также оценивали путем определения экспрессии S100-β в опухолевых тканях. S100-β — это антитело, которое наиболее часто используется в клинических условиях для подтверждения цитологического диагноза меланомы.Потеря экспрессии S100-β обычна при метастатических поражениях и остается наиболее чувствительным маркером опухолей меланоцитарного происхождения ( 46 ). Экспрессия S100-β не могла наблюдаться в опухолях групп ICG + NIR и I-TRAIL + NIR (фиг. 6Q). Напротив, наблюдалась очевидная экспрессия S100-β в группах I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR, что указывает на менее метастатическую стадию опухолей. CD63 — еще один широко известный антиметастатический ген при злокачественной меланоме. Подавляющая роль CD63 в инвазии меланомы частично обусловлена ​​его ассоциацией с интегрином β 1 и его взаимодействием со специфическими субстратами ЕСМ ( 47 ).Инвазивность клеток меланомы после подавления экспрессии CD63 наблюдалась в группах ICG + NIR и I-TRAIL + NIR на 12 день после лечения (фиг. 6R). Напротив, повышенный уровень CD63 в местных опухолевых тканях был показан в других тестируемых группах, с самым высоким уровнем в группе I-P-OMV + NIR. Эти результаты предоставляют дополнительные доказательства, указывающие на то, что I-P-OMV + NIR могут значительно уменьшить метастазирование меланомы путем активации экспрессии S-100β и CD63.

    Чтобы проверить, может ли более высокая интенсивность NIR привести к дальнейшему усилению противоопухолевых свойств I-P-OMV + NIR, мы разработали третью волну лечения.В частности, доза NIR-лазера была установлена ​​равной 2 Вт / см 2 в течение 3 минут, позволяя температуре в участках опухоли достичь 51 ° C после раздражения. Все экспериментальные параметры и концентрации TRAIL, ICG и OMV остаются такими же, как указано выше. Используя лечение PBS в качестве холостого контроля, мы сосредоточились на оценке влияния I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR в меланоме. При увеличении интенсивности NIR не только опухоли быстро очищались, но и значительно замедлялся рецидив опухолей (рис.S6). Кроме того, в течение как минимум 25 дней не определялась наблюдаемая опухоль (рис. S6, A и B). В этой волне исследования у подопытных животных не наблюдалось потери веса (рис. S6C), что напомнило о биобезопасности лечения I-P-OMV + NIR даже при высокой плотности лазера.

    Эти местные ткани на 25 день после обработки окрашивали гематоксилин-эозином (H&E) и иммунологическим анализом на мелан-А. Топические ткани групп I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR показали гистологию кожи (рис.S6D). Однако ткань показала очевидную морфологию меланомы в группе PBS. Эти результаты подтверждаются результатом идентификации мелана-А, который является классическим поверхностным маркером меланоцитарных клеток ( 5 ). Сильная экспрессия мелана-A была показана в контрольной группе PBS. Для групп I-OMV + NIR и I-R-OMV + NIR наблюдались некоторые уровни экспрессии мелана-A. Однако в группе I-P-OMV + NIR мелан-A обнаружен не был. В совокупности было продемонстрировано, что однократная доза I-P-OMV + NIR при 0,6 или 2 Вт / см 2 в течение 3 минут задерживает рецидив опухоли по меньшей мере на 8 и 25 дней соответственно.Эти результаты предоставили дополнительные доказательства в гипотезе о том, что раздражение NIR может сенсибилизировать клетки меланомы к TRAIL и давать синергетические терапевтические эффекты при меланоме.

    Биобезопасность IP-OMV in vivo + NIR

    Органы всех тестируемых животных, собранные на 12-й день (рис. S7), 8-й день (рис. S8) и 25-й день (рис. S9) в первую очередь, вторая и третья волны исследований, соответственно, подвергались окрашиванию H&E. Окрашивание H&E показало, что применение in vivo всех тестируемых схем не привело к повреждению органов.Ни других признаков токсичности, ни побочных эффектов у подопытных животных не наблюдалось. Наряду с увеличенной массой тела подопытных животных (фиг. 6J и фиг. S5C и S6C) все эти результаты продемонстрировали, что лечение I-P-OMV + NIR безопасно и хорошо переносится для биоприложений in vivo.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Клеточные линии

    Клетки A375, B16F10, L02 и RAW264.7 были получены из Американской коллекции типовых культур (Шанхай, Китай). Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% (об. / Об.) FBS, пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 .Мышей C57BL / 6 J были приобретены у Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd., Китай.

    Анализ микромасштабного термофореза

    Взаимодействия между c-RGDyK или RWrNMGGGGIVRRADRAAVP и человеческим рекомбинантным интегрином α v β 3 (R&D Systems) определяли с помощью анализа связывания на микроуровне термофореза (Германия). Измеряли изменения термофоретического движения меченного флуоресценцией NT-647 (Monolith NTT Protein Labeling Kit, NanoTemper Technologies, Германия) α v β 3 интегрина , культивированного с c-RGDyK или RWrNMGGGGIVRRADRAAVP. K d рассчитывали на основе шести независимых измерений термофореза с использованием программного обеспечения NanoTemper.

    Измерение связывания пептидов с α

    v β 3 интегрином с помощью проточной цитометрии

    Клетки B16F10 и L02 (10 6 клеток на лунку) высевали в шестилуночные планшеты и культивировали в 2 мл среды при 37 ° C. ° C в течение 24 часов с последующей инкубацией с 5 мкМ пептидами-кандидатами в течение дополнительных 2 часов. Клетки дважды промывали PBS при 4 ° C и измеряли интенсивность внутриклеточной флуоресценции с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur, BD Biosciences, США).

    Спектроскопический анализ кругового дихроизма

    Вторичную структуру RWrNMGGGGIVRRADRAAVP определяли с помощью анализа кругового дихроизма (CD). RWrNMGGGGIVRRADRAAVP растворяли в PBS (pH 7,4), и спектры КД регистрировали на спектрополяриметре J-815 при 20 ° C с набором параметров шириной полосы 1,0 нм в диапазоне от 190 до 260 нм, разрешением 0,1 нм, длина пути 100 мкм, время отклика 4 с и скорость сканирования 50 нм / мин. Оптическую плотность PBS вычитали для калибровки спектров c-RGDyK и RWrNMGGGGIVRRADRAAVP.

    Стабильность RWrNMGGGGIVRRADRAAVP

    в сыворотке. Стабильность RWrNMGGGGIVRRADRAAVP в сыворотке определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). RWrNMGGGGIVRRADRAAVP (50 нМ) инкубировали с 50% FBS в течение 4, 8 и 12 часов. Супернатант анализировали с помощью ВЭЖХ (Shimadzu, Япония).

    Цитотоксичность RWrNMGGGGIVRRADRAAVP

    Цитотоксичность RWrNMGGGGIVRRADRAAVP против нормальных клеток печени человека L02 оценивали с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтенилметразида (MT).Вкратце, клетки L02 (4 × 10 3 клеток на лунку) высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов при 37 ° C. В каждую лунку добавляли различные концентрации RWrNMGGGGIVRRADRAAVP. Через 48 часов среду удаляли и клетки дважды промывали PBS, после чего добавляли 150 мкл раствора МТТ (0,5 мг / мл). После 4 часов инкубации раствор МТТ заменяли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) с последующим осторожным встряхиванием для растворения кристаллов формазана.Поглощение измеряли с помощью ридера для микропланшетов (200 Pro, Tecan, США) при 570 нм.

    Получение и модификация OMV

    pDNA-рекомбинантный человеческий TRAIL (Sangon Biotechnology Inc., Китай) трансформировали в E. coli методом теплового шока с образованием T– E. coli . Вкратце, 100 мкл компетентной E. coli смешивали с 1 мкл pDNA-TRAIL (0,1 мкг / мкл) и инкубировали на ледяной бане в течение 30 мин. После этого смесь нагревали при 42 ° C в течение 100 с. После стадии теплового шока смесь выдерживали на льду еще 6 мин.Впоследствии этим бактериям добавляли свежую среду LB и инкубировали в шейкере при 37 ° C в течение 1,5 часов. Затем полученную культуру распределяли на чашке с агаром LB, содержащей канамицин (50 мкг / мл), и инкубировали при встряхивании в течение 18 часов при 37 ° C. Выжившие клоны T– E. coli собирали и далее культивировали в среде LB, содержащей канамицин (50 мкг / мл) до оптической плотности (OD) 0,6 при 600 нм. Затем соответствующее количество культуры переносили в свежую среду LB, содержащую канамицин (50 мкг / мл), и инкубировали в течение ночи при 37 ° C при встряхивании.После расширенного культивирования T– E. coli OMV собирали из супернатанта бактериальной культуры на ультрацентрифуге (Optima MAX-XP, США). Затем собранные OMV фильтровали через фильтр 0,22 мкм (Thermo Fisher Scientific) и очищали с использованием ультрафильтрационных мембран с отсечкой 100 кДа (Millipore). Для детоксикации OMV инкубировали с лизоцимом (конечная концентрация 2 мг / мл) при 37 ° C при встряхивании в течение 1,5 часов. Затем OMV инкубировали с RGD (25 мкг / мл) и RGP (25 мкг / мл) соответственно при 37 ° C при встряхивании в течение 1 часа с последующим центрифугированием при 150000 g в течение 2 часов для получения R- OMV и P-OMV.OMV, R-OMV и P-OMV дополнительно инкубировали с ICG (1 мг / мл) и ультрацентрифугировали при 150000 г в течение 2 часов, чтобы удалить свободный ICG и получить IR-OMV, IP-OMV и I- OMV для дальнейшего использования.

    Характеристика OMV

    Размер частиц и дзета-потенциал OMV измеряли с помощью Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, UK). Морфологию OMV наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ; JEM-2100). DiI (1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат) –OMV отслеживали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM; Olympus, Япония).Белок TRAIL в OMV и бактериальных клетках оценивали с помощью анализа WB. Белок TRAIL в OMV определяли с помощью ELISA (Boster, Китай). Вкратце, соответствующее количество суспензии OMV лизировали клеточным лизатом и встряхивали на льду в течение 10 минут. После центрифугирования при 14000 об / мин супернатант собирали. Стандарт TRAIL, поставляемый в коммерческом наборе для ELISA, представляет собой белок TRAIL (аминокислоты от 95 до 281), количества белка TRAIL (аминокислоты от 114 до 281), содержащегося в OMV, рассчитывали с помощью корректирующего уравнения.Количество ICG измеряли с помощью спектрометра в ультрафиолетовой и видимой (UV-Vis) области (TU 1900, Китай) при 785 нм. Эффективность захвата (LE) ICG в OMV рассчитывалась следующим образом: LE (%) = (вес захваченного ICG) / (общий вес белка OMV) × 100%. RGD или RGP инкубировали с OMV при массовом соотношении 2,5: 1 в течение 1 часа. RGD или RGP были прикреплены к OMV путем введения пальмитиновой кислоты на RGD / RGP в фосфолипидные слои OMV. RGD-OMV и RGP-OMV собирали с помощью ультрацентрифуги (Optima MAX-XP, США), а супернатанты анализировали с помощью ВЭЖХ для измерения концентраций свободных RGP или RGD.Скорости сопряженных RGD или RGP и OMV рассчитывались следующим образом: Скорость прививки% = ( Вт 0 Вт 1 ) / Вт OMV × 100%. W 0 — общий вес RGD или RGP, W 1 — вес RGD или RGP в супернатантах и ​​ W OMV — общий вес белка OMV.

    Воспалительный потенциал OMV in vitro и in vivo

    RAW264.7 (5 × 10 3 ) клеток высевали на 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали OMV (с обработкой лизоцимом или без нее) и LPS (1 мкг / мл), соответственно, в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO 2 . Уровни TNF-α и IL-6 в клеточном супернатанте измеряли с помощью ELISA. Все экспериментальные процедуры на животных выполнялись в соответствии с руководящими принципами и протоколами Комитета по этике экспериментов на животных Чжэцзянского университета. In vivo мышей случайным образом разделили на восемь групп: PBS, LPS, I-OMV (0.5 мг / кг), I-OMV (0,75 мг / кг), IR-OMV (0,5 мг / кг), IR-OMV (0,75 мг / кг), IP-OMV (0,5 мг / кг) и IP-OMV ( 0,75 мг / кг). Для группы LPS, LPS (10 мг / кг) вводили внутрибрюшинно мышам C57BL / 6 в течение 3 дней, чтобы вызвать модель воспаления. В других группах мышей анестезировали, а кожу спины удаляли. После восстановления полноценной функции на кожу наносили OMV на 24 часа. Затем мышей умерщвляли и определяли уровни TNF-α и IL-6 в обработанной коже (гомогенат) с помощью ELISA.

    Определение синглетного кислорода

    Генерация синглетного кислорода I-OMV определялась с использованием DPBF в качестве зонда синглетного кислорода. Для этого готовили суспензию I-OMV путем диспергирования I-P-OMV в ацетонитриле (1 мкг / мл) и хранили в темноте. Раствор DPBF (15 мкл, 60 мкМ) добавляли к 1 мл суспензии и тщательно перемешивали с последующим облучением NIR при 0,6 или 2 Вт / см 2 в течение 3 мин. Уменьшение интенсивности УФ-поглощения при 412 нм пропорционально производству синглетного кислорода, и значение поглощения регистрировали за минуту.Генерацию синглетного кислорода в суспензии I-P-OMV (без NIR) измеряли в качестве холостого контроля.

    Высвобождение TRAIL из OMV, запускаемое ближним инфракрасным излучением.

    Суспензию

    OMV переносили пипеткой в ​​диализную мембрану и погружали в PBS. Диализаты собирали в заранее определенные моменты времени. Указанным группам проводили БИК-облучение (2 Вт / см 2 в течение 3 минут) на 6-й час. Количество высвобожденного белка TRAIL определяли с помощью ELISA.

    Инфильтрация I-P-OMV в трехмерные сфероиды меланомы

    In vitro трехмерный сфероид B16F10 был разработан с использованием техники наложения жидкости.Вкратце, раствор агарозы наносили на планшет с лунками. Затем клетки B16F10 высевали с плотностью 3 × 10 4 клеток на лунку в 96-луночном планшете. Затем пластины осторожно встряхивали, и образовывались опухолевые сфероиды. После 7 дней культивирования однородные и компактные опухолевые сфероиды обрабатывали Dil-OMV. После этого инфильтрацию OMV в сфероиды опухоли наблюдали с помощью CLSM и анализировали с помощью программного обеспечения FluoView FV1000 и Imaris.

    Тест жизнеспособности клеток

    Цитотоксичность I-OMV in vitro исследовали с помощью анализа МТТ.Клетки B16F10 и A375 высевали в 96-луночные культуральные планшеты с плотностью 3 × 10 4 клеток на лунку в 100 мкл полной среды. После инкубирования в течение ночи клетки обрабатывали I-TRAIL, I-OMV, I-R-OMV и I-P-OMV (1 мкг / мл) в течение 12 часов. I-TRAIL представлял собой простую смесь растворов белков ICG и TRAIL. После этого этапа указанные группы раздражали ближним инфракрасным светом (2 Вт / см 2 в течение 3 минут). Затем проводили анализ МТТ в клетках после дальнейшего культивирования в течение 12 часов.Вкратце, среду заменяли свежей средой (80 мкл) и 20 мкл МТТ (5 мг / мл). Среду удаляли через 4 часа инкубации с МТТ. В каждую лунку добавляли ДМСО (150 мкл), и кристалл полностью растворялся за счет низкоскоростных колебаний в течение 10-15 мин на шейкере. Значения OD каждой лунки измеряли при 570 нм.

    Анализ апоптоза клеток

    Апоптоз клеток анализировали с помощью набора для обнаружения апоптоза Annexin V – FITC (Beyotime) и определяли проточным цитометром (Beckman Coulter, США).Клетки B16F10 и A375 высевали в шестилуночные культуральные планшеты с плотностью 3 × 10 6 клеток на лунку в 2 мл среды. После инкубирования в течение ночи клетки обрабатывали I-TRAIL, I-OMV, I-R-OMV и I-P-OMV (1 мкг / мл) в течение 12 часов. После этого этапа указанные группы были раздражены ближним инфракрасным светом (2 Вт / см 2 в течение 3 минут). После дополнительной 6-часовой инкубации клетки собирали и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при 4 ° C. Затем клетки окрашивали 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл иодида пропидия в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре.Наконец, апоптоз клеток анализировали на проточном цитометре (Beckman Coulter, США) в течение 1 часа.

    Transwell assay

    Клетки высевали в 24-луночные культуральные планшеты в течение ночи. После обработки I-TRAIL, I-OMV, I-R-OMV и I-P-OMV (1 мкг / мл) в течение 12 часов указанные группы облучали NIR (2 Вт / см 2 в течение 3 минут). После дополнительной 12-часовой инкубации клетки затем переваривали и ресуспендировали в бессывороточной среде с плотностью 1,0 × 10 5 клеток / мл. Кроме того, 100 мкл клеточной суспензии высевали в верхнюю камеру, а среду с высоким содержанием сахара, содержащую 10% FBS, добавляли к нижнему слою.После дальнейшего культивирования при 37 ° C в течение 48 часов камеру удаляли, а клетки в верхнем слое мембраны осторожно вытирали. Клетки, проникшие в нижний слой, фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали кристаллическим фиолетовым (Beyotime, Шанхай, Китай) и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии (Nikon, Япония).

    Мониторинг клеточной инвазии в реальном времени без меток

    Клетки высевали в 24-луночные культуральные планшеты в течение ночи, а затем обрабатывали I-TRAIL, I-OMV, IR-OMV и IP-OMV (1 мкг / мл. ) в течение 12 часов.Указанные группы были облучены методом NIR (2 Вт / см 2 в течение 3 минут). После дополнительной 12-часовой инкубации клетки затем переваривали и ресуспендировали в бессывороточной среде с плотностью 1,0 × 10 5 клеток / мл. Кроме того, 110 мкл клеточной суспензии высевали в верхнюю камеру и 165 мкл среды с высоким содержанием сахара, содержащей 10% FBS, добавляли к нижнему слою. Кинетику миграции клеток регистрировали с помощью прибора xCELLigence RTCA DP (Roche) в течение приблизительно 24 часов.

    Конструирование библиотеки мРНК и секвенирование

    Полную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, США) и очищали с помощью магнитных шариков, прикрепленных к поли-Т олиго. Затем мРНК фрагментируется на небольшие кусочки с использованием двухвалентных катионов при повышенной температуре. Затем расщепленные фрагменты РНК подвергали обратной транскрипции для создания конечной библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) в соответствии с протоколом для TruSeq RNA Sample Preparation v2 (каталоги RS-122-2001 и RS-122-2002, Illumina, США).Средний размер вставки для библиотек с парными концами составлял 300 ± 50 пар оснований (п.о.). Затем мы выполнили секвенирование парных концов на Illumina NovaSeq 6000 в (LC Sciences, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным поставщиком.

    Последовательность и первичный анализ

    Библиотеку кДНК, созданную с помощью технологии из объединенной РНК клеток B16F10 до и после обработки, секвенировали, используя платформу для последовательностей Illumina NovaSeq 6000. Используя метод секвенирования РНК на парных концах (RNA-seq) компании Illumina, мы секвенировали транскриптом, генерируя в общей сложности 2 миллиона считываний парных концов по 150 п.н.Это дало гигабазы ​​последовательности. Перед картированием низкокачественные чтения (1, чтения, содержащие адаптеры для секвенирования; 2, чтения, содержащие праймер для секвенирования; 3, нуклеотид с показателем качества q ниже 20), удалялись. После этого было произведено около 8 ГБ каждой пробы очищенных считываний с парных концов.

    RNA-seq reads картирование

    Мы выровняли считывания обработанных клеток и пустых клеток с последовательностями полного генома для Mus musculus (мышь), как предоставлено Калифорнийским университетом, Санта-Крус (mm10, декабрь 2011 г.).Отображенные чтения каждого образца были собраны с помощью StringTie. Затем все транскриптомы из образцов были объединены, чтобы восстановить полный транскриптом с использованием скриптов Perl. После создания последнего транскриптома StringTie и edgeR использовали для оценки уровней экспрессии всех транскриптов. StringTie использовали для определения уровня экспрессии мРНК путем расчета FPKM (количество фрагментов на килобазу на миллион отображенных считываний). Дифференциально экспрессируемые мРНК и гены были отобраны с log 2 (кратное изменение) ≥1 со статистической значимостью ( P <0.05) пакетом R.

    Выделение РНК

    , массивы ПЦР и ОТ-ПЦР

    РНК

    выделяли с помощью набора для очистки РНК TRIzol Plus (Invitrogen) и подвергали обратной транскрипции с помощью SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix для qRT-PCR (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. . Master Mix Power SYBR Green PCR (Applied Biosystems) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Относительный уровень экспрессии каждого гена был статистически проанализирован с помощью 2 (контрольный ген C t — C t целевой ген) .

    Анализ WB

    Набор для экстракции общего белка (коктейль с ингибитором протеазы) использовали для экстракции общего белка, а набор для анализа белка BCA (ab102536) использовали для количественного определения общего белка. В качестве первичных используемых антител являются антитела против TRAIL (Abcam), против E-кадгерина (Abcam), против кавеолина-1 [Cell Signaling Technology (CST)], против MET (CST), против RAB27A (Affinity), против -Расщепленная каспаза 3 (CST), анти-расщепленная каспаза 8 (CST), анти-виментин (Abcam), анти-расщепленная PARP (Abcam). Полосы белка детектировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), и с усиленной хемилюминесценцией.Пленки сканировали с помощью SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate. ImageJ использовали для анализа значений OD полос. Относительная экспрессия целевого белка = {целевой белок (значение OD) / внутренний эталон (значение OD)} × 10 n , и результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение. Экспрессию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы использовали в качестве контроля нагрузки.

    Тесты проникновения через кожу

    Для тестирования проникновения OMV через кожу in vitro мышей C57BL / 6 (возраст 4 недели) анестезировали, а спинную кожу удаляли.После восстановления его полной функции на кожу наносили свободный FITC-BSA, OMVs-GFP, R-OMVs-GFP и P-OMVs-GFP (10 мкг на мышь) соответственно. Через 6 часов мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и собирали кожу спины. Затем кожу промывали и превращали в парафин и разрезали на кусочки толщиной 6 мкм в соответствии со стандартными протоколами. Глубину проникновения OMV наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Для тестирования трансдермальной доставки OMV in vitro использовали кожу мышей C57BL / 6 с диффузионными клетками Франца.Растворы OMV (OMV, R-OMV и P-OMV, 1 мкг / мл) добавляли к каждой донорской клетке. Образцы (100 мкл) отбирали из диффузионной камеры с разными интервалами (0,5, 1, 2, 4, 8, 10 и 24 часа), и добавляли свежий PBS. Количество белка TRAIL в диффузионной камере определяли с помощью набора для ELISA. Другие образцы кожи, обработанные P-OMV через 12 часов, были приготовлены в парафин и нарезаны на кусочки толщиной 6 мкм по стандартизованным протоколам и исследованы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) и TEM.Для распространения in vivo мышей анестезировали, а кожу спины удаляли. После восстановления его полной функции за мышами наблюдали в системе визуализации in vivo (Maestro EX, США) через 1, 3 и 6 часов после местного нанесения свободных DiI и DiI-P-OMV (10 мкг на мышь). Основные органы и опухоли мышей собирали и наблюдали через 6 часов после местного нанесения DiI-P-OMV.

    Модель на животных и противоопухолевые характеристики in vivo

    Клетки B16F10 (3 × 10 6 клеток на мышь) инокулировали подкожно в правый бок мышей C57BL / 6 для создания модели меланомы.Лечение проводилось при достижении объемов первичной опухоли 100 мм 3 . В первой волне лечения мышей случайным образом разделили на восемь групп и местно вводили суспензии ICG, I-TRAIL, IB-OMV, IRB-OMV, IPB-OMV, I-OMV, IR-OMV и IP-OMV ( 0,5 мг OMV / кг мышей) соответственно. Во второй волне лечения применялось раздражение NIR, мышей рандомизировали на пять групп ( n = 6): ICG + NIR, I-TRAIL + NIR, I-OMV + NIR, IR-OMV + NIR и IP. -OMVs + NIR.Концентрации TRAIL, ICG и OMV такие же, как и при первой волне лечения. Через 12 часов после введения неинфильтрованное лекарственное средство с поверхности кожи было удалено. Мышей анестезировали, и всю область опухоли облучали NIR-лазером (808 нм, 0,6 Вт / см 2 ) в течение 3 минут. В третьей волне лечения применялось раздражение в ближней инфракрасной области с более высокой плотностью; мышей случайным образом разделили на четыре группы: PBS, I-OMV + NIR, I-R-OMV + NIR и I-P-OMV + NIR (0,75 мг OMV / кг мышей).Через 12 часов после введения всю область опухоли облучали NIR-лазером с более высокой плотностью мощности 2 Вт / см 2 в течение 3 минут для достижения температуры 51 ° C в участках опухоли. Объем опухолей и массу тела мышей регистрировали с первого дня до конца эксперимента. Объем опухоли рассчитывали по следующей формуле: ширина 2 × длина × 0,5. Показатели выживаемости мышей регистрировали до 30 дня после обработки. Все основные органы подопытных животных были собраны и исследованы путем окрашивания H&E.

    TUNEL assay

    Использовали набор для обнаружения гибели клеток in situ, POD (Roche), и эксперимент проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, замороженные срезы обрабатывали протеиназой К (20 мкг / мл), а затем окрашивали флуоресцеин-дезоксиуридинтрифосфатом (зеленый) в течение 90 мин. Положительные контроли предварительно обрабатывали дезоксирибонуклеазой (1 ед. / Мл), а отрицательные контроли инкубировали без концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы. Затем все срезы контрастировали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом.Флуоресцентные изображения апоптотических клеток (зеленый) и ядер клеток (синий) были получены с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM510.

    Гистологический и иммуногистохимический анализ

    Гистологический анализ проводили путем окрашивания H&E. Набор раствора для окрашивания меланином Masson-Fontana (Sbjbio) использовали для окрашивания меланина в коже и опухолевых тканях. Для иммуногистохимии срезы опухоли заливали парафином. Иммуногистохимия выполнялась депарафинизацией, поиском антигена, пермеабилизацией и блокированием в 5% BSA.В качестве первичных используемых антител используются антитела против расщепленной каспазы 3 (Servicebio), анти-CD63 (Servicebio) и анти-S100-β (Servicebio). Использовали вторичные антитела, конъюгированные с HRP. После контрастного окрашивания гематоксилином изображения получали с помощью микроскопа (Eclipse Ti-S, Nikon).

    Статистический анализ

    Данные выражены в виде средних значений ± стандартное отклонение. Для сравнения между двумя группами средние значения сравнивали с использованием непарных двусторонних тестов Стьюдента t . Односторонний дисперсионный анализ с достоверной достоверной разницей Тьюки был проведен для анализа нескольких выборок.Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 8 (GraphPad Software Inc.).

    Благодарности: Финансирование: Исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2018YFC1105404, 2019YFA0802800, 2018YFB1105400), Национальным фондом естественных наук Китая (81473145), ключевым проектом на уровне центрального правительства (2060302). ) и Фонд развития науки и технологий Макао, Специальный административный район Макао, Китай. Вклад авторов: L.-H.P., X.-H.N., J.-Q.G. и Z.-H.J. задумал проект. L.-H.P., M.-Z.W., Y.C., L.Z., J.N., H.-T.S. и T.-J.Y. провели эксперименты и провели формальный анализ данных. L.-H.P, X.-H.N и J.-Q.G. написал рукопись. Все авторы обсудили результаты и прокомментировали рукопись. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
      Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
      браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
      Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
    потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
    не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
    остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Везикулы наружной мембраны, полученные из E. coli, в качестве новых носителей для трансдермальной доставки и доставки на опухоль

    Трансдермальная доставка лекарств предпочтительна в клинической терапии из-за ее способности преодолевать недостатки, связанные с удалением печени при первом прохождении, вызванные традиционным пероральным введением, и необратимостью инъекции. Однако роговой слой кожи (SC) образует большой барьер, препятствующий проникновению большинства биомакромолекул.В настоящем документе мы предлагаем создание трансформированных везикул внешней мембраны, полученных из Escherichia coli ( E. coli ), детоксифицированных лизоцимами (называемыми TEV) в качестве носителя для трансдермальной доставки лекарственного средства. TEV были получены из трансгенной E.coli , а затем модифицированы целевым пептидом интегрина альфа (v) бета (3) (αvβ3) и совместно загружены индоцианиновым зеленым (ICG) (P-TEVs-G). Было показано, что TEV превосходно проникают через неповрежденный SC без какого-либо дополнительного усиления с последующим нацеливанием на клетки меланомы.TEV представляют собой многообещающие наноплатформы для трансдермальной доставки лекарств и доставки лекарств, нацеленной на опухоли, с высокой эффективностью и биобезопасностью, обладающие большим потенциалом в лечении поверхностных опухолей.

    У вас есть доступ к этой статье

    Подождите, пока мы загрузим ваш контент.

    Previous PostNextNext Post

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *